琚鵬舉，寧蕾，葛林豪，許成杰，史華偉，梁凱歌，馬亮，劉陶然，陳明，孫黛珍

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030800；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3中央民族大學(xué)，北京 100081；4石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，石家莊 050047）

0 引言

【研究意義】目的基因的拷貝數(shù)一直是植物基因組研究的重要內(nèi)容。外源基因整合進(jìn)入受體基因組的位置和拷貝數(shù)會(huì)影響目的基因的表達(dá)以及遺傳穩(wěn)定性，而插入基因的拷貝數(shù)相對(duì)其插入位點(diǎn)而言影響更為重要[1]。當(dāng)外源基因以低拷貝數(shù)（1—2個(gè)）整合到受體基因組時(shí)，通常能夠穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)，多拷貝數(shù)的整合則會(huì)造成基因不穩(wěn)定表達(dá)，甚至沉默[2]。因此，鑒定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的外源基因插入拷貝數(shù)非常重要[3]。由于小麥基因組龐大復(fù)雜，優(yōu)化和建立高通量拷貝數(shù)分析方法對(duì)于對(duì)小麥轉(zhuǎn)基因育種研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，微滴式數(shù)字 PCR（droplet-based digital PCR，ddPCR）是最新興起的一項(xiàng)核酸檢測(cè)技術(shù)[4-6]。該技術(shù)不依賴任何校準(zhǔn)物，采用直接計(jì)數(shù)單個(gè)分子的原理，實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸檢測(cè)的絕對(duì)定量[7-8]。ddPCR已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域，如核酸絕對(duì)定量、稀有突變檢測(cè)和拷貝數(shù)檢測(cè)等[9]。ddPCR具有高精確度的特點(diǎn)，在檢測(cè)目的基因拷貝數(shù)時(shí)，利用目標(biāo)基因與參考基因的雙重反應(yīng)，通過(guò)計(jì)算它們的比值，即可快速獲得目標(biāo)基因拷貝數(shù)。這種方法由于試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，已經(jīng)成為了檢測(cè)基因拷貝數(shù)的首選方法[10]。與傳統(tǒng)方法相比較，ddPCR具有明顯優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)在操作流程更加簡(jiǎn)單，無(wú)需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，且是對(duì)待檢測(cè)的核酸分子直接進(jìn)行絕對(duì)定量，試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠[11]。此外，ddPCR在線性范圍、檢測(cè)極限和定量極限等方面均優(yōu)于qRT-PCR方法[12]。諸多研究表明，ddPCR已用于玉米、水稻等作物轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)的檢測(cè)[13-14]。SUN等[15]的研究表明運(yùn)用 ddPCR技術(shù)可以在甘蔗復(fù)雜基因組中明確確定內(nèi)源參考基因拷貝數(shù)，COLLIER等[16]研究中使用雙重ddPCR獲得了水稻、小麥、玉米、番茄、馬鈴薯和柑桔類物種的高質(zhì)量轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)測(cè)量值。其中提到 ddPCR分析產(chǎn)生的拷貝數(shù)測(cè)量值非常接近整數(shù)值，通常與使用Southern blot雜交得出的結(jié)論相近。并且，基于ddPCR的方法在基因組非常大的物種（如小麥和玉米）中也能很好地發(fā)揮作用，但傳統(tǒng)的DNA印跡雜交方法在這一方面卻極富挑戰(zhàn)性。因此快速準(zhǔn)確地確定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)并鑒定大量樣品的半合子和純合子的能力使 ddPCR成為植物生物學(xué)研究人員的強(qiáng)大工具。【本研究切入點(diǎn)】六倍體小麥因其基因組龐大復(fù)雜（約17 Gb），利用傳統(tǒng)Southern blot等方法檢測(cè)拷貝數(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無(wú)法達(dá)到高通量檢測(cè)的要求，當(dāng)需要對(duì)大量的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)進(jìn)行拷貝數(shù)分析時(shí)，傳統(tǒng)方法無(wú)法滿足要求?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥抗逆分子育種課題組利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)nib8小麥為試驗(yàn)材料，以小麥PINb-D1b（籽粒硬度）為參考基因[15]，期望通過(guò)數(shù)字 PCR技術(shù)建立一種快速穩(wěn)定的小麥基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法，為促進(jìn)小麥基因組研究以及基因工程研究提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年10月，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院順義基地種植轉(zhuǎn)nib8小麥株系（由中國(guó)農(nóng)科院作物科學(xué)研究所小麥抗逆分子育種課題組提供）和揚(yáng)麥16（受體）。

1.2 內(nèi)參基因和目標(biāo)基因引物設(shè)計(jì)

選取位于小麥 D基因組中的單拷貝純合基因PINb-D1b（籽粒硬度）作為試驗(yàn)內(nèi)參基因[17]，通過(guò)引物的篩選和比較，確定專一性和特異性強(qiáng)的引物（表1）。設(shè)計(jì)Wx012（蠟質(zhì)基因）和SSII（淀粉合成酶）2個(gè)內(nèi)參基因的引物和探針，確保探針的特異性（表1）。

表1 數(shù)字PCR 探針引物序列Table 1 Sequences of probes and primers used in digital PCR

1.3 樣本DNA的提取

結(jié)合CTAB法和全自動(dòng)核酸提取儀提取法提取樣本DNA[18]。

1.4 片段化基因組

用EcoRⅠ（NEB公司）對(duì)葉片基因組DNA進(jìn)行核酸內(nèi)切酶預(yù)處理，每微克DNA加入1個(gè)單位EcoRⅠ。37℃處理過(guò)夜，65℃ 30 min使酶失活，并將模板DNA稀釋為 20 μg·μL-1。

1.5 制備反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)

采用以DNA為模板的探針?lè)?。反?yīng)體系見表2，反應(yīng)條件為95℃ 3 min；95℃ 30 s，57℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；98℃ 10 min。為保證高效的模板擴(kuò)增，PCR儀的升降溫速度需低于2℃·s-1。

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 2 PCR amplification reaction system

1.6 微滴分析

將 96孔板放入微滴分析儀中，讀取微滴熒光信號(hào)，從而判斷微滴的陽(yáng)性或陰性。使用 QuantaSoft V1.3.2軟件計(jì)算每個(gè)樣品目的序列的微滴數(shù)（拷貝/μL）[19]，泊松分布的置信區(qū)間為 95%；然后根據(jù)內(nèi)參基因的拷貝數(shù)計(jì)算待測(cè)目的基因的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 引物的特異性篩選

選用轉(zhuǎn)nib8小麥株系為模板，使用表1的4個(gè)基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出的條帶均為單一目的條帶，表明引物具有特異性。

圖1 4對(duì)引物的特異性擴(kuò)增Fig. 1 Specific amplification results of four pairs of primers

2.2 退火溫度的篩選

通過(guò)對(duì)退火溫度的梯度分析，在6個(gè)溫度條件下，nib8均表現(xiàn)出良好的擴(kuò)增圖形，且隨著退火溫度的升高，nib8的陰性微滴和陽(yáng)性微滴區(qū)分的愈發(fā)明顯，擴(kuò)增越來(lái)越特異（圖2-A）。圖2-B中內(nèi)參基因隨著退火溫度的升高，擴(kuò)增效率變化不明顯。因此，為使nib8和內(nèi)參基因均能表現(xiàn)出良好的擴(kuò)增效果，最終以59℃作為最優(yōu)退火溫度。

2.3 靈敏度（檢測(cè)低限）和準(zhǔn)確性檢測(cè)

2.3.1 DNA模板濃度的篩選 由圖3可知，nib8在4個(gè)不同模板濃度下均擴(kuò)增出良好的微滴分離現(xiàn)象，隨著濃度的增加，微滴數(shù)增加。然而，nib8在160 ng模板濃度時(shí)，陽(yáng)性微滴和陰性微滴已無(wú)法明顯分開，在320 ng模板濃度時(shí)，該現(xiàn)象愈發(fā)明顯。模板濃度越高，體系擴(kuò)增效果越差，微滴不能明顯分開，而模板為20 ng時(shí)的微滴數(shù)較少，無(wú)法明顯看出擴(kuò)增效果，因此，最終選定40 ng為最佳模板濃度。

2.3.2 特異性檢測(cè) 使用QuantaSoft V1.3.2軟件對(duì)6個(gè)轉(zhuǎn)nib8小麥株系的拷貝數(shù)進(jìn)行分析。由圖4可以看出陽(yáng)性微滴數(shù)和陰性微滴數(shù)區(qū)分明顯，說(shuō)明體系穩(wěn)定。由表3可以看出數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果中有3個(gè)株系為1個(gè)拷貝，可以用于進(jìn)一步基因功能分析。

2.4 體系驗(yàn)證及應(yīng)用

2.4.1 不同檢測(cè)方法的比較 由表 4中可以看出數(shù)字 PCR的檢測(cè)結(jié)果與通過(guò)染料法和探針?lè)ㄟM(jìn)行的real-time PCR分析結(jié)果一致。由圖5可以看出轉(zhuǎn)nib8小麥第16號(hào)株系的Southern blot結(jié)果也與數(shù)字PCR結(jié)果一致，均是1個(gè)拷貝。

圖2 不同退火溫度條件下nib8（A）和內(nèi)參基因（B）的數(shù)字PCR檢測(cè)Fig. 2 Digital PCR detection of nib8 (A) and internal reference genes (B) at different annealing temperatures

圖3 不同模板濃度條件下nib8（A）和內(nèi)參基因（B）的數(shù)字PCR檢測(cè)Fig. 3 Digital PCR results of nib8 gene(A) and control gene (B) at different template concentrations

圖4 轉(zhuǎn)nib8株系特異性檢測(cè)Fig. 4 Specific detection of nib8 strains was performed

表3 轉(zhuǎn)nib8株系的數(shù)字PCR檢測(cè)低限測(cè)定結(jié)果Table 3 The results of low limit determination by digital PCR were obtained by transplanting nib8 strain

2.4.2 內(nèi)參基因的選擇 在內(nèi)參基因的選擇上，除小麥D基因組中的單拷貝純合基因（PINb-D1b）外，同時(shí)還開發(fā)了其他小麥內(nèi)源基因作為拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)參基因。

以Wx012和SSII為內(nèi)參基因檢測(cè)部分轉(zhuǎn)nib8小麥株系目標(biāo)基因的拷貝數(shù)（圖6和圖7），其結(jié)果與用PINb-D1b為內(nèi)參基因的分析結(jié)果一致，都是1個(gè)拷貝，證明這3個(gè)基因都可作為內(nèi)參基因用于小麥目標(biāo)基因拷貝數(shù)數(shù)字PCR分析。

圖5 轉(zhuǎn)nib8小麥第16號(hào)株系的Southern blot檢測(cè)Fig. 5 Southern blot results of nib8 transgenic wheat line 16

表4 探針?lè)ā⑷玖戏ê蛿?shù)字PCR的結(jié)果對(duì)比Table 4 Comparison between fluorescence quantitative method such as probe method and dye method, and digital PCR method

圖6 內(nèi)參基因的拷貝數(shù)分析Fig. 6 Copy number analysis of internal reference genes

圖7 轉(zhuǎn)nib8株系的拷貝數(shù)分析Fig.7 Copy number analysis of transferred nib8 lines

2.4.3 靶基因不同區(qū)段的檢測(cè)效果驗(yàn)證 在nib8的不同區(qū)段進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)，分別以PINb-D1b、Wx012和SSII為內(nèi)參基因檢測(cè)nib8拷貝數(shù)，結(jié)果均一致（圖8-A，圖8-B），第12號(hào)轉(zhuǎn)nib8小麥株系的拷貝數(shù)都是7（圖8-C）。

圖8 在nib8不同位置設(shè)計(jì)引物的結(jié)果圖（第12號(hào)轉(zhuǎn)nib8株系）Fig.8 Results of designing primers at different positions of nib8 gene (take 12 strains as an example)

3 討論

3.1 不同拷貝數(shù)檢測(cè)方法的比較

目前，小麥拷貝數(shù)檢測(cè)方法很多，但用數(shù)字PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小麥外源基因拷貝數(shù)報(bào)道較少。經(jīng)典的外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法主要有 qRT-PCR和 Southern blot。其中qRT-PCR分析方法的步驟較為繁瑣，首先需要準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn) DNA樣品，然后利用此樣品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，而標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立又涉及體系的摸索與優(yōu)化，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力，所需試驗(yàn)周期較長(zhǎng)[20]；另外，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量本身就是一種相對(duì)定量方法，所以試驗(yàn)結(jié)果并不準(zhǔn)確[21]。而傳統(tǒng)的Southern blot方法不但對(duì)DNA需求量大，試驗(yàn)操作步驟復(fù)雜，而且對(duì)人員操作的技術(shù)要求比較高[22]。與定量PCR不同，數(shù)字PCR無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA樣品絕對(duì)定量的靈敏、準(zhǔn)確。一個(gè)PCR反應(yīng)被分成許多獨(dú)立的反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)都有一個(gè)陽(yáng)性或陰性的信號(hào)。應(yīng)用泊松統(tǒng)計(jì)量，直接從陽(yáng)性反應(yīng)和陰性反應(yīng)的數(shù)量計(jì)算出原始樣品中DNA分子的數(shù)量。本研究中數(shù)字PCR模板要求低，而且相比Real-time PCR的靈敏性（0.1 pg·μL-1）高，數(shù)字 PCR 靈敏性能達(dá)到 0.001 pg·μL-1，是Real-time PCR的100多倍。相比Southern blot，數(shù)字PCR試驗(yàn)周期短，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)通量高。

3.2 體系準(zhǔn)確性的比較

一步多重PCR（multiplex PCR）又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是指在同一PCR反應(yīng)體系中添加2對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，且每對(duì)引物只對(duì)應(yīng)1個(gè)[23]靶標(biāo)片段，與常用的RAPD技術(shù)（1對(duì)引物對(duì)應(yīng)多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物）[24]全然不同?？紤]到二重微滴式數(shù)字PCR不僅能避免單重ddPCR定量因二次取樣所產(chǎn)生的樣品內(nèi)的誤差，而且可以消除不同樣品 DNA因取樣不一致而造成的樣品間的誤差，所以本研究采用二重PCR反應(yīng)擴(kuò)增，選用了3個(gè)不同的小麥單拷貝基因Wx012、PIN-b1和SSII作內(nèi)參基因，其中以PIN-b1為內(nèi)參基因時(shí)，Wx012和SSII的拷貝數(shù)為1（圖6）。又以這3個(gè)基因?yàn)閮?nèi)參基因檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系12的拷貝數(shù)時(shí)，結(jié)果也相同。為了檢驗(yàn)表達(dá)是否一致，在nib8序列的不同區(qū)段設(shè)計(jì)引物，結(jié)果顯示一致。為了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究選擇小麥基因組里的其他2個(gè)單拷貝基因Wx012和SSII作為內(nèi)參基因檢測(cè)PIN-b1[25]。以此來(lái)檢測(cè)該體系的準(zhǔn)確性。

3.3 數(shù)字PCR檢測(cè)小麥拷貝數(shù)方法的應(yīng)用

本研究建立的檢測(cè)體系短時(shí)間內(nèi)可以檢測(cè)幾百個(gè)樣品，大大提高了工作效率。本研究建立的拷貝數(shù)方法不僅可以檢測(cè)外源基因。也可以檢測(cè)內(nèi)源基因的拷貝數(shù)。因此，本方法具有快速、靈活、高效、所需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，而且已經(jīng)在基因表達(dá)研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因成分鑒定等諸多領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景[26-28]。BURNS等[29]應(yīng)用數(shù)字 PCR來(lái)評(píng)估幾種轉(zhuǎn)基因分析方法的檢測(cè)限。

DOBNIK等[30]應(yīng)用數(shù)字 PCR技術(shù)，針對(duì)歐盟授權(quán)的 12種轉(zhuǎn)基因玉米品系建立了轉(zhuǎn)基因成分多重定量分析方法。目前，該技術(shù)已經(jīng)快速應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。

4 結(jié)論

建立了針對(duì)小麥雙重微滴式數(shù)字 PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法。確定了引物和探針的最佳終濃度分別為500和250 nmol·L-1，退火溫度為59℃。該檢測(cè)方法可以選用3個(gè)內(nèi)參基因（Wx012、PIN-b1和SSII）。