樊 莉 王仁睿 余 馬 劉金煥 侯大斌 唐志康

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010)

白及(Bletillastriata)為蘭科(Orchidaceae)白及屬(Bletilla)多年生草本植物，主要分布于我國陜西南部、甘肅東南部、江蘇、安徽、四川、貴州、云南、湖南等地[1]。據(jù)《中國藥典》記載，白及干燥塊莖具有收斂止血，消腫生肌的功效，可用于咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒和皮膚皸裂[2]，為我國常用的中草藥。白及富含聯(lián)芐類、白及膠、菲類化合物等成分，可起到美白、抗衰老等作用，廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)[3]。此外，白及還被應(yīng)用于食品工業(yè)、煙草工業(yè)等多領(lǐng)域。因此白及具有重要的開發(fā)價(jià)值，市場需求量巨大。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，白及的年需求在4 000噸以上[4]。

白及藥材主要來源于野生資源，但長期的過度挖掘使白及野生資源急劇萎縮，目前白及已被列入國家珍稀瀕危保護(hù)植物名錄[5]和《瀕危野生動(dòng)植物國際貿(mào)易公約(CITES)》[6]。白及的人工繁殖以塊莖繁殖為主，但繁殖系數(shù)較低，成本高，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求[7]。人工規(guī)?；敝呈菍?shí)現(xiàn)白及藥用資源可持續(xù)發(fā)展的必由之路。組織培養(yǎng)技術(shù)以規(guī)?；?、低成本為優(yōu)勢(shì)，目前已逐漸成為白及人工繁育的重要技術(shù)手段。

白及的組織培養(yǎng)相關(guān)研究中，種子是最為常用的外植體材料[8～11]。白及的蒴果中通常含有數(shù)萬顆無胚乳的種子，通過人工組培可極大地提高繁殖系數(shù)，蒴果易于消毒，污染率低，且有利于保持親本優(yōu)良性狀[12]。但通過種子繁殖的苗由于數(shù)量多，生長較為細(xì)弱，需要一段時(shí)間才能健壯，且性狀上也會(huì)有一定差異。其次幼根[13]、莖尖[14]、側(cè)芽[15]、原球莖[16]和塊莖[17]也被用作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，但與種子相比，這些外植體培養(yǎng)分化時(shí)間長、分化效率較低，該類研究數(shù)量較少。由此可見，繼續(xù)篩選適宜的外植體，建立效率高、周期短的組織培養(yǎng)體系對(duì)于白及的工廠化生產(chǎn)具有重要意義和廣闊前景。本文以白及假鱗莖為外植體，采用切取假鱗莖薄片的方式，探索假鱗莖薄片不同部位、不同激素種類與濃度配比的培養(yǎng)基，比較假鱗莖薄片不同厚度的褐化程度及出芽數(shù)，篩選適合假鱗莖直接誘導(dǎo)不定芽的方式，通過正交設(shè)計(jì)篩選組培苗的增殖培養(yǎng)基，以期建立以假鱗莖薄片組織誘導(dǎo)不定芽為技術(shù)核心、簡單高效的快繁體系，為白及的繁育提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料與方法

供試材料白及(Bletillastriata)由同一母株分苗擴(kuò)繁而成,由樂山市樂福生物科技有限責(zé)任公司提供。

1.1 外植體消毒

以白及的塊莖為外植體，飽和漂白粉水浸泡10 min，自來水沖洗0.5 h，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡外植體30 s，無菌水清洗1次，0.1%升汞+1～2滴吐溫滅菌15 min，無菌水沖洗5次，接種于MS+BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7.0 g·L-1[17]的培養(yǎng)基上進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，其中MS+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7.0 g·L-1為基本培養(yǎng)基(BM)，pH5.8，培養(yǎng)溫度26±1℃，光照為12 h·d-1，光照強(qiáng)度1 500 lx，培養(yǎng)6周。

1.2 芽的壯苗及假鱗莖的誘導(dǎo)

選取生長正常的芽，接種于BM+1.0 mg·L-1NAA+30 g·L-1香蕉泥的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6周進(jìn)行壯苗和假鱗莖的誘導(dǎo)[18]，培養(yǎng)環(huán)境同1.1。

1.3 假鱗莖薄片誘導(dǎo)不定芽

將壯苗后的苗(見圖1a)誘導(dǎo)出的假鱗莖(見圖1b)平均切成上、中、下3個(gè)部位(見圖1c)，分別接種于添加不同質(zhì)量濃度的NAA、BA和TDZ的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周，以篩選出最佳的部位及不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將篩選出的假鱗莖最佳部位按照0.5～1.0、1.1～1.5和1.6～2.0 mm的厚度切取薄片，接種到最佳的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，探索不同厚度對(duì)褐化率和出芽率的影響。每個(gè)處理10個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同1.1。

1.4 增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)的芽分別接種于添加不同質(zhì)量濃度的BA和NAA的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)6周，以篩選出最佳的增殖培養(yǎng)基。每個(gè)處理10個(gè)不定芽，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同1.1。

1.5 壯苗和生根培養(yǎng)

取增殖后的不定芽接入到1/2MS+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1GA3+2.0 g·L-1活性炭+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周，進(jìn)行壯苗及生根培養(yǎng)[19]。培養(yǎng)條件同1.1。

1.6 移栽

將苗高5～7 cm、根系生長良好的白及苗小心從培養(yǎng)瓶中取出，清洗干凈根部附著的培養(yǎng)基，浸泡于500倍多菌靈溶液中10 min，晾干后栽種于滅過菌的基質(zhì)上，基質(zhì)組成為椰糠∶黃土∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1∶1[20]，基質(zhì)含水量保持在70%～80%。加強(qiáng)通風(fēng)換氣保濕，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.7 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

出芽率(%)=誘導(dǎo)出芽的假鱗莖薄片數(shù)量/接種假鱗莖薄片總數(shù)

(1)

褐化率(%)=褐化的假鱗莖薄片數(shù)量/接種假鱗莖薄片總數(shù)

(2)

增殖系數(shù)=一個(gè)周期內(nèi)形成的有效苗數(shù)/接種苗數(shù)

(3)

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 假鱗莖的不同部位、激素對(duì)白及假鱗莖薄片誘導(dǎo)不定芽的影響

將白及假鱗莖不同部位接種于不同激素濃度和配比培養(yǎng)基上，試驗(yàn)設(shè)計(jì)為4因素3水平正交試驗(yàn)，假鱗莖薄片培養(yǎng)1周后可見到不定芽開始生長(見圖1d)，3周后，芽長至2～3 cm(見圖1e)。由表1可知，最佳處理為7號(hào)處理，即白及假鱗莖下部薄片在BM+2.0 mg·L-1BA+1.0 mg·L-1TDZ，出芽率為93.3%，平均出芽數(shù)為15個(gè)，顯著高于其他培養(yǎng)基(見表1)。由表2～3可得4個(gè)因素對(duì)出芽率和出芽數(shù)的作用大小關(guān)系為假鱗莖部位>TDZ>BA>NAA。假鱗莖的部位對(duì)出芽率和出芽數(shù)的影響最大且極顯著(P<0.01)，下部的出芽率為83.3%～93.3%(見表1)，顯著高于上部和中部。TDZ和BA對(duì)假鱗莖薄片的出芽率和出芽數(shù)的影響顯著(P<0.05)，NAA對(duì)假鱗莖薄片出芽率影響不顯著。

表1 不同部位的假鱗莖薄片、激素濃度和配比處理對(duì)不定芽的誘導(dǎo)情況

Table 1 Effect on different position of pseudobulb transverse thin cell layer sections and growth regulator concentration for shoot regeneration ofB.striata

編號(hào)No.因素Factor(mg·L-1)部位PositionNAABATDZ出芽率Induction rate(%)出芽數(shù)(個(gè))The number of shoots1上部Upper position0.00.00.03.3±3.3b0.3±0.3c2上部Upper position0.51.01.026.7±8.8b2.7±0.9c3上部Upper position1.02.02.026.7±6.7b2.7±0.7c4中部Middle position0.01.02.020.0±5.8b2.0±0.6c5中部Middle position0.52.00.023.3±6.7b2.3±0.7c6中部Middle position1.00.01.030.0±10.0b3.0±1.0c7下部Lower position0.02.01.093.3±3.3a15.0±1.5a8下部Lower position0.50.02.083.3±3.3a9.0±1.0b9下部Lower position1.01.00.090.0±5.8a11.7±2.2ab

注：不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著，下同。

Note: Different lowercase letters mean significant difference atP<0.05 level,the same as below.

表2 白及假鱗莖薄片出芽率的方差分析

Table 2 Analysis of variance of induction rate from pseudobulb transverse thin cell layer sections ofB.striata

變異來源Source of variation平方和Sum of square自由度df均方Mean of squareF值F value顯著性sig.部位Position5.68522.84375.990.000NAA0.07420.0370.990.391BA0.29420.1473.9310.038TDZ0.29920.1493.990.037誤差Error0.673180.037總計(jì)Sum7.02526

表3 白及假鱗莖薄片出芽數(shù)的方差分析

Table 3 Analysis of variance of the number of shoots from pseudobulb transverse thin cell layer sections ofB.striata

變異來源Source of variation平方和Sum of square自由度df均方Mean of squareF值F value顯著性sig.部位Position568.5192284.25975.9900.000NAA7.40723.7040.9900.391BA29.407214.7043.9310.038TDZ29.852214.9263.9900.037誤差Error67.333183.741總計(jì)Sum702.51926

圖1 白及假鱗莖薄片誘導(dǎo)及快繁體系 a.用作切片的白及苗；b.假鱗莖；c.假鱗莖平均切成上、中、下3部位；d.誘導(dǎo)1周后的假鱗莖薄片；e.誘導(dǎo)3周的假鱗莖薄片；f. 0.5～1.0 mm厚度的假鱗莖薄片褐化嚴(yán)重；g. 1.6～2.0 mm厚度的假鱗莖薄片褐化輕微；h. 9號(hào)培養(yǎng)基上增殖6周的白及苗；i.生根的白及苗；j.移栽1個(gè)月后的白及苗；k.移栽3個(gè)月后的白及苗Fig.1 Shoot regeneration from pseudobulb transverse thin cell layers and micropropagation of B.striata a. An in vitro plant used for excision of pseudobulb transverse thin cell layer for shoot regeneration; b. A pseudobulb; c. A pseudobulb was cut averagely for three transverse thin cell layers- upper part, middle part and lower part; d. A pseudobulb transverse thin cell layer was cultured on a medium for one week; e. A pseudobulb transverse thin cell layer was cultured on a medium for three weeks; f. A pseudobulb transverse thin cell layer(0.5-1.0 mm in thickness) was obvious browning; g. A pseudobulb transverse thin cell layer(1.6-2.0 mm in thickness) was scarce browning; h. The shoots were micropropagated on No.9 medium; i. A plantlet with roots; j. A plant after transplantation for one month; k. Growth vigour plants in soil three months after ex vitro transfer

2.2 不同厚度的假鱗莖薄片對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

假鱗莖薄片的厚度對(duì)于不定芽的誘導(dǎo)影響很大，0.5～1.0 mm的假鱗莖薄片最易褐化(見圖1f)，褐化率高達(dá)76.7%，隨著厚度的增加，褐化率呈明顯下降的趨勢(shì)，出芽數(shù)增加。1.6～2.0 mm的假鱗莖薄片不易褐化(見圖1g)，褐化率為6.7%，出芽數(shù)最多，達(dá)16.7個(gè)，顯著優(yōu)于0.5～1.0和1.1～1.5 mm(見表4)。

表4 不同厚度的假鱗莖薄片對(duì)不定芽誘導(dǎo)的情況

Table 4 Effect on thickness of pseudobulb transverse thin cell layer sections for shoot regeneration

厚度Thickness(mm)褐化率The browning rate(%)出芽數(shù)The number of shoots(ind.)0.5～1.076.7±3.3a4.7±2.2b1.1～1.526.7±14.5b8.3±0.7b1.6～2.06.7±5.8b16.7±1.9a

2.3 不同激素濃度和配比對(duì)不定芽增殖的影響

BA和NAA的不同濃度配比對(duì)不定芽增殖具有顯著的影響(見表5)。9個(gè)配方中，增殖系數(shù)為1.5～4.3，平均苗高為1.7～4.7 cm，9號(hào)培養(yǎng)基(BM+1.5 mg·L-1BA+0.3 mg·L-1NAA)增殖效果顯著優(yōu)于其他培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)4.3，平均苗高為7.8 cm，為最佳增殖培養(yǎng)基(見圖1h)。

表5 不同激素濃度和配比對(duì)不定芽增殖的情況

Table 5 Effect on different growth regulator concentration for shoot multiplication

編號(hào)No.因素Factor(mg·L-1)BANAA增殖系數(shù)The multiplication factor平均苗高Length of shoots(cm)10.50.11.5±0.3d2.7±0.1f20.50.31.8±0.2cd3.0±0.1ef30.50.52.2±0.2bcd3.4±0.2e41.00.12.2±0.2bcd4.6±0.1d51.00.32.5±0.2bc5.4±0.1c61.00.52.9±0.2b5.9±0.1c71.50.12.9±0.2b6.6±0.1b81.50.33.5±0.2ab7.0±0.1b91.50.54.3±0.1a7.8±0.2a

2.4 生根和移栽

白及組培苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)6周后，假鱗莖和根系生長健壯(見圖1i)，適合進(jìn)行移栽。1個(gè)月后，植株存活率達(dá)85%，根系明顯生長(見圖1j)3個(gè)月后植株長至12～15 cm，生長旺盛(見圖1k)。

3 討論

本研究建立了以假鱗莖薄片誘導(dǎo)不定芽為關(guān)鍵技術(shù)的快繁技術(shù)體系。在誘導(dǎo)不定芽過程中，探索了假鱗莖部位、TDZ、BA和NAA對(duì)出芽率和出芽數(shù)的作用情況，假鱗莖部位影響極顯著，下部的出芽率為93.3%，出芽數(shù)為15個(gè)，顯著高于上部和中部；TDZ和BA對(duì)出芽率和出芽數(shù)影響顯著，NAA影響不顯著；假鱗莖薄片厚度以1.6～2.0 mm為宜，不易褐化；不定芽的最優(yōu)培養(yǎng)方式為：假鱗莖下部薄片(1.6～2.0 mm)在BM+2.0 mg·L-1BA+1.0 mg·L-1TDZ上培養(yǎng)3周。最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基為BM+1.5 mg·L-1BA+0.3 mg·L-1NAA，培養(yǎng)6周后，增殖系數(shù)達(dá)4.3。經(jīng)過壯苗和生根后白及組培苗即可進(jìn)行移栽。以一棵白及苗來計(jì)算，假鱗莖3個(gè)部位薄片最多可誘導(dǎo)不定芽個(gè)數(shù)為20個(gè)，增殖后可達(dá)86棵，因此，該體系與之前的研究相比，大大提高了白及的繁殖效率。

眾多學(xué)者在白及的快速繁殖上主要采取種子無菌播種的方式，但種子萌發(fā)成苗后植株過于孱弱，需要較長的時(shí)間用以壯苗。部分研究以塊莖、側(cè)芽、原球莖等作為外植體，但污染問題始終存在，而且對(duì)于蘭科植物而言，再生途徑的周期較長是普遍存在的問題[21]。本研究以組培苗的假鱗莖為材料，以假鱗莖薄片為材料直接誘導(dǎo)不定芽，可極大地規(guī)避污染的風(fēng)險(xiǎn)，而且植株健壯，可直接用于增殖和生根，有效節(jié)約時(shí)間。

將植物器官切成薄片作為外植體進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)已在多種植物上有所應(yīng)用，如菊花[22]、越南人參[23]、黃細(xì)心[24]、草類[25]、蘋果[26]、鐵皮石斛[27]、花椒[28]等。其中在百合[29]、蘭花[30]等幾種植物上已報(bào)道假鱗莖薄片作為外植體進(jìn)行器官誘導(dǎo)。薄片誘導(dǎo)不定芽的形式是一種高效的再生方式，過程中無愈傷組織的形成，極大地避免了遺傳變異的風(fēng)險(xiǎn)[31]。

假鱗莖的不同厚度存在褐化情況明顯不同的現(xiàn)象，本研究比較了3種厚度假鱗莖薄片的褐化率，結(jié)果表明假鱗莖薄片厚度越小，褐化率越高，出芽數(shù)也少。0.5～1.0 mm的假鱗莖薄片其褐化率高達(dá)76.7%，出芽率為4.7；1.6～2.0 mm的假鱗莖薄片其褐化率為6.7%，出芽數(shù)為16.7，顯著優(yōu)于0.5～1.0 mm和1.1～1.5 mm的假鱗莖薄片，為最適宜的外植體。類似結(jié)果在其他研究中有相關(guān)描述，劉玫等[31]指出大花惠蘭的薄片小于1.0 mm時(shí)，誘導(dǎo)效果不理想，外植體容易褐化死亡，2 mm左右的切片可直接誘導(dǎo)形成類原球莖。

本研究的結(jié)果顯示假鱗莖的部位對(duì)不定芽的出芽率和出芽數(shù)影響極顯著，下部的薄層顯著優(yōu)于上部和中部，分析原因是由于假鱗莖是蘭科植物常見的、極度縮短的莖，節(jié)間過密。根據(jù)李筑蓀等[33]的報(bào)道，春蘭的假鱗莖上部和中部為稀節(jié)區(qū)，下部為密節(jié)區(qū)。白及可能與春蘭類似，下部是節(jié)相對(duì)集中的部位，隱芽數(shù)量多，因此在下部進(jìn)行切片進(jìn)行誘導(dǎo)可獲得較高的出芽率和出芽數(shù)。如需闡明這一原因需要進(jìn)一步對(duì)白及假鱗莖的不同部位進(jìn)行解剖學(xué)觀察。

生長素和細(xì)胞分裂素在器官發(fā)生的過程中是非常必要的，TDZ、BA和NAA被廣泛應(yīng)用于薄片誘導(dǎo)的相關(guān)報(bào)道中，如10 μm TDZ最適合菜豆薄片誘導(dǎo)不定芽[34]；Teixeira da Silva and Fukai[22]報(bào)道菊花的莖薄片在不同的激素種類中誘導(dǎo)情況不同，2 mg·L-1的BA對(duì)誘導(dǎo)不定芽有效，TDZ對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織有效，NAA對(duì)誘導(dǎo)根有效；1.5 mg·L-1的BA和0.5 mg·L-1NAA是最適合黃細(xì)心的莖切片誘導(dǎo)不定芽的激素組合[24]。本研究結(jié)果表明TDZ和BA對(duì)白及假鱗莖薄片誘導(dǎo)不定芽起到顯著影響。不同的植物在誘導(dǎo)不定芽時(shí)對(duì)激素的種類需求不同，一是可能和基因型有關(guān)，二是可能和植物的內(nèi)源激素有關(guān)。BA和NAA已被證實(shí)在白及組培苗的增殖中起到積極的作用[13～14]，本研究中BA和NAA的組合也在增殖過程中取得了較好的效果，最佳增殖培養(yǎng)基為BM+1.5 mg·L-1BA+0.3 mg·L-1NAA。本研究成功建立了以白及假鱗莖薄片誘導(dǎo)不定芽為關(guān)鍵技術(shù)的快繁技術(shù)體系，繁殖效率高，周期短，避免了變異的風(fēng)險(xiǎn)，為白及種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定了基礎(chǔ)。