王勝芳 韓淑蘭 黨士坤 王慧梅

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi.)為唇形科(Labiatae)多年生草本植物，是一種典型的藥食同源藥材，具有清熱燥濕、解毒、止血和安胎的功效[1]，對(duì)慢性疾病患者有良好的保健作用[2]。黃芩還是一種良好的天然抑菌劑，臨床抗菌性能好且無(wú)耐藥性[3～4]，其提取物具有抗炎[5]、抗氧化[6]和抗腫瘤[7]的作用。因此，黃芩具有較高的研究?jī)r(jià)值，目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)黃芩中藥材需求量也日益增加，但我國(guó)野生黃芩資源有限無(wú)法滿足巨大的市場(chǎng)需求。植物組織培養(yǎng)離體繁殖技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)繁殖出生長(zhǎng)速度快，次生代謝產(chǎn)物含量高的優(yōu)良無(wú)性系，而且對(duì)外界環(huán)境的依賴性低，管理方便，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此黃芩的快速繁殖技術(shù)已成為解決該問(wèn)題的重要手段之一。但在黃芩的組織培養(yǎng)過(guò)程中，組培苗玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重制約了這一技術(shù)的應(yīng)用。

近年來(lái)，有不少的專家學(xué)者針對(duì)試管苗玻璃化的機(jī)制進(jìn)行研究，并取得了一定的進(jìn)展，其中被大眾廣泛認(rèn)可的觀點(diǎn)是AgNO3通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)乙烯的作用位點(diǎn)抑制乙烯的合成及信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制保衛(wèi)細(xì)胞中H2O2的積累，導(dǎo)致氣孔的密度及孔徑增大，失水量增加，植物玻璃化程度減輕，進(jìn)而發(fā)生逆轉(zhuǎn)[8]。

本研究首先以組培黃芩玻璃化苗為材料，研究AgNO3對(duì)玻璃化苗的逆轉(zhuǎn)作用，確定AgNO3的最適濃度；在此基礎(chǔ)上，對(duì)恢復(fù)了1個(gè)月的黃芩玻璃化苗中活性成分的含量及其生物活性進(jìn)行研究。為黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將2個(gè)月的黃芩實(shí)生苗莖段于75%酒精溶液中殺菌30 s，然后用無(wú)菌水清洗3遍，再用4%的NaClO消毒2 min，無(wú)菌水清洗3～5遍，用無(wú)菌的干燥濾紙吸干其表面的水分，剪成1 cm左右的莖段，接種于MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7 g·L-1固體培養(yǎng)基中，25 d后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7 g·L-1中,待再生芽長(zhǎng)到1 cm左右時(shí)轉(zhuǎn)到繼代增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7 g·L-1中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，1個(gè)月后將獲得的玻璃化苗和正常的組培苗用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 研究方法

1.2.1 AgNO3對(duì)黃芩玻璃化苗的逆轉(zhuǎn)作用

將黃芩的玻璃化苗接種到MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7 g·L-1+AgNO3(不同濃度)的培養(yǎng)基中，AgNO3的濃度為0，2，4，6，8，10 mg·L-1，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行，每瓶接種10棵，30 d后統(tǒng)計(jì)黃芩玻璃化苗的逆轉(zhuǎn)率。

1.2.2 黃芩苷含量的測(cè)定

采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)黃芩苷的含量進(jìn)行定量檢測(cè)[9]。稱取新鮮的植物樣品0.2 g在液氮中研磨成粉。以60%的乙醇溶液(10 mL)為提取溶劑，采用超聲處理法(30 min，60℃)提取黃芩苷。重復(fù)3次，合并濾液并離心(10 000 r·min-1，15 min)，取上清液濃縮、過(guò)濾后，上機(jī)檢測(cè)。

測(cè)定方法：使用的HPLC系統(tǒng)由Waters1525高效液相色譜儀、Waters2478檢測(cè)器和Waters SunFire C18色譜柱(250 nm×4.6 mm，5 μm)組成。流動(dòng)相為甲醇∶水(含0.2%的磷酸溶液)=35∶65(V∶V)，流速為1 mL·min-1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量20 μL。測(cè)得黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=2.134X+3.15(R2=0.990 7)，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中黃芩苷的含量。

1.2.3 黃芩提取物的抗氧化活性檢測(cè)

采用DPPH自由基清除法[10]檢測(cè)黃芩提取物的抗氧化能力。10 mg DPPH溶解于100 mL甲醇中，得0.1 mg·mL-1的DPPH貯備液。向盛有1 mL樣品提取液(制備方法同1.2.2)的各離心管中加入2 mL DPPH溶液，混勻后立即用比色皿在517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i。室溫避光保存30 min后再次測(cè)定吸光值，記為Aj。對(duì)照組吸光值記為Ac，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行。

DPPH自由基的清除率的公式：

清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%

(1)

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制：200 mg的抗壞血酸溶于20 mL甲醇，得10 mg·mL-1抗壞血酸溶液，再將其依次稀釋為1.25，0.625，0.312 5，0.156 25，0.078 125 mg·mL-1，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=40.414X+44.913(R2=0.995 4)，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計(jì)算IC50值。

1.2.4 黃芩提取物的體外抑菌試驗(yàn)

細(xì)菌的活化：挑取3～5株大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、鮑曼不動(dòng)桿菌(A.Bauman)分別接種到含5 mL LB培養(yǎng)基的試管中，震蕩培養(yǎng)24 h。將活化的菌液倒入盛有20 mL LB培養(yǎng)液的玻璃瓶中，再震蕩培養(yǎng)4～7 h，將菌液濃度調(diào)整為1×106CFU·mL-1左右。

藥品的制備：稱取2 g干燥的植物樣品研磨成粉，加入70%的乙醇溶液100 mL超聲提取1 h，重復(fù)提取3次，離心后合并上清液，將上清液蒸干得到黃芩活性物質(zhì)。稱取黃芩活性物質(zhì)20 mg，用1 mL的超純水溶解完全，得到20 mg·mL-1的抑菌液，以2倍稀釋法梯度稀釋抑菌液至20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.312 5 mg·mL-1，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾后備用。

1.2.4.1 抑菌圈直徑的測(cè)定

采用打孔法[11]檢測(cè)黃芩提取物的抑菌直徑。分別取100 μL濃度為1×106CFU·mL-1的菌液均勻涂布于含LB固體培養(yǎng)基的平板表面，用滅菌打孔器在平板上均勻打出4個(gè)孔。在每個(gè)孔注入500 μg·mL-1黃芩提取液各100 μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)24 h。以生理鹽水為對(duì)照，測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.2.4.2 最小抑菌濃度(MIC)

用96孔板做最小抑菌濃度試驗(yàn)[12～13]，每孔加入濃度為1×106CFU·mL-1的活化菌液100 μL，再分別加入濃度為20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.312 5 mg·mL-1的樣品提取液各100 μL，只加菌液的孔為對(duì)照孔，每個(gè)濃度重復(fù)3次。37℃條件下培養(yǎng)24 h，在600 nm處檢測(cè)菌液OD值找到最小的抑菌濃度。

1.2.4.3 最小殺菌濃度(MBC)

用接種環(huán)分別蘸取1.2.4.2試驗(yàn)所得的菌液劃平板，培養(yǎng)48 h，看是否有菌落出現(xiàn)，若無(wú)菌落出現(xiàn)則該濃度就是最小殺菌濃度。

1.2.5 黃芩提取物抗腫瘤活性的檢測(cè)

采用MTT法[14～15]檢測(cè)黃芩提取物的抗腫瘤活性。將0.8×105細(xì)胞/mL的宮頸癌(Hela)和肺腺癌(A549)細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，加入100 μL黃芩提取物(提取方法如1.2.4)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)濃度50、25、12.5 mg·mL-1，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加入20 μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用移液槍吸去所有的培養(yǎng)液，并向每孔中加入150 μL DMSO，振搖10 min，用酶標(biāo)儀在OD=490 nm處測(cè)每孔的吸光值，記為A。調(diào)零孔與對(duì)照孔的吸光值，分別記為A0和A對(duì)照。收集數(shù)據(jù)并計(jì)算黃芩提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除率。

清除率=1-(A-A0)/A對(duì)照×100%

(2)

1.2.6 數(shù)據(jù)的分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNO3對(duì)組培玻璃化黃芩苗的恢復(fù)作用

由圖1可知，AgNO3的濃度為4 mg·L-1時(shí)，玻璃化苗的逆轉(zhuǎn)率最高為88%，且恢復(fù)苗的生長(zhǎng)狀態(tài)良好。AgNO3的濃度低于4 mg·L-1時(shí)，玻璃化苗的逆轉(zhuǎn)率較低，玻璃化苗依然存在著玻璃化現(xiàn)象。而當(dāng)AgNO3的濃度高于4 mg·L-1時(shí)，玻璃化苗在恢復(fù)的過(guò)程中出現(xiàn)了不同程度的枯萎，導(dǎo)致玻璃化苗的死亡率不斷地升高，且隨著AgNO3濃度的升高，玻璃化苗的枯萎程度不斷加重。

圖1 AgNO3對(duì)黃芩玻璃化苗的逆轉(zhuǎn)作用 圖中相同小寫字母表示在0.05水平上差異不顯著，不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。Fig.1 The recovery efficiency of AgNO3 on S.baicalensis plantlets The same lowercase letter in the figure indicates that the difference is not significant at the 0.05 level,while different lowercase letters indicates that the difference is significant at the 0.05 level,the same as below.

2.2 黃芩苗體內(nèi)黃芩苷含量的測(cè)定

黃芩苷是黃芩中最主要的次生代謝產(chǎn)物，其含量的高低直接決定黃芩的質(zhì)量。根據(jù)黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算可得(圖2)，玻璃化苗(HS)中黃芩苷的含量為38.32 mg·g-1，恢復(fù)苗(RS)中黃芩苷的含量為68.56 mg·g-1，正常組培苗(CS)中黃芩苷的含量為108.21 mg·g-1?；謴?fù)苗中黃芩苷的含量顯著高于玻璃化苗，但卻明顯低于正常組培苗，僅為正常組培苗的60%多。

圖2 黃芩苗中黃芩苷的含量Fig.2 The content of Baicalin in S.baicalensis plantlets

圖3 黃芩提取物對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of S.baicalensis extract on DPPH free radical

2.3 黃芩苗提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)

人體內(nèi)自由基含量過(guò)高可引發(fā)多種疾病，如動(dòng)脈粥樣化、神經(jīng)變性、慢性抑郁癥、癌癥和生理學(xué)衰老等。因此，研究黃芩體內(nèi)活性成分對(duì)自由基的清除作用對(duì)于評(píng)價(jià)黃芩質(zhì)量的好壞具有一定的指導(dǎo)意義。由圖3可知隨著樣品濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除率也在逐漸增加。由圖3可知恢復(fù)苗(RS)的IC50值為0.22 mg·mL-1，稍高于正常組培苗(CS)0.17 mg·mL-1，但顯著低于玻璃化苗(HS)1.27 mg·mL-1，僅為玻璃化苗的1/6。

2.4 黃芩提取物的體外抑菌試驗(yàn)

由表1可知，黃芩提取物對(duì)金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)、鮑曼不動(dòng)桿菌(A.Bauman)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)均具有良好的抑制效果。正常組培苗(CS)對(duì)各種細(xì)菌的抑制效果最佳，抑菌圈的直徑最大，其次是恢復(fù)苗(RS)，抑菌效果最差的是玻璃化苗(HS)。由表2可知，黃芩提取物對(duì)革蘭式陽(yáng)性菌(S.aureus和E.coli)的抑制效果優(yōu)于革蘭式陰性菌(A.Bauman和B.subtilis)，尤其是對(duì)S.aureus的抑制效果最佳。黃芩提取物對(duì)革蘭式陽(yáng)性菌的MIC及MBC值較低，均小于10 mg·mL-1，而對(duì)革蘭式陰性菌特別是A.Bauman的MBC值則高于20 mg·mL-1。

表1 黃芩提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用

Table 1 Inhibitory effect ofS.baicalensisextract on bacteria

抑菌圈直徑Inhibition zone(mm)CSRSHSH2O金黃色葡萄球菌S.aureus17.77±0.1613.52±0.1311.98±0.130大腸桿菌E.coli13.13±0.1011.41±0.079.21±0.110枯草芽孢桿菌B.subtilis10.48±0.138.03±0.178.22±0.040鮑曼不動(dòng)桿菌A.Bauman9.12±0.106.92±0.166.89±0.070

表2 黃芩提取物的最小抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)

Table 2 Minimum inhibitory concentration(MIC) and minimum bactericidal concentration(MBC) ofS.baicalensisextract

黃芩提取物的濃度Drug concentration(mg·mL-1)CSRSHSMICMBCMICMBCMICMBC金黃色葡萄球菌S.aureus1.252.52.552.55大腸桿菌E.coli2.552.55510枯草芽孢桿菌B.subtilis51010201020鮑曼不動(dòng)桿菌A.Bauman102020—20—

2.5 黃芩提取物的抗腫瘤活性試驗(yàn)

由圖4可知，黃芩提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞和Hela宮頸癌細(xì)胞具有良好的殺傷作用。相同濃度下正常組培苗(CS)提取液對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的殺傷率最大，其次是恢復(fù)苗(RS)，殺傷率最低的是玻璃化苗(HS)。且隨著黃芩提取物濃度的增加，各樣品對(duì)A549肺癌細(xì)胞和Hela宮頸癌細(xì)胞的殺傷率也顯著升高。

圖4 黃芩提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞和Hela宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用Fig.4 The killing effect of S.baicalensis extract on A549 cells and Hela cells

3 討論

研究表明，AgNO3能控制和逆轉(zhuǎn)組培苗的玻璃化現(xiàn)象。Gao等[8]研究了AgNO3對(duì)玻璃化石竹的逆轉(zhuǎn)作用及其逆轉(zhuǎn)機(jī)制，其研究結(jié)果指出在培養(yǎng)基中添加濃度為5 mg·L-1的AgNO3對(duì)玻璃化石竹的逆轉(zhuǎn)作用最強(qiáng)，而且提出AgNO3對(duì)玻璃化石竹的逆轉(zhuǎn)機(jī)制是通過(guò)爭(zhēng)奪乙烯的作用位點(diǎn)抑制乙烯的生成，使植物體內(nèi)活性氧含量降低，從而減輕或逆轉(zhuǎn)組培植物的玻璃化現(xiàn)象。本研究同樣證明了AgNO3對(duì)玻璃化黃芩苗具有逆轉(zhuǎn)作用，且其逆轉(zhuǎn)作用受AgNO3濃度的影響，AgNO3濃度為4 mg·L-1時(shí)，玻璃化苗的逆轉(zhuǎn)率最高為88%，且恢復(fù)苗的生長(zhǎng)狀態(tài)良好。AgNO3的濃度低于4 mg·L-1時(shí)，玻璃化苗的逆轉(zhuǎn)率較低，玻璃化苗依然存在著玻璃化現(xiàn)象。而當(dāng)AgNO3的濃度高于4 mg·L-1時(shí)，玻璃化苗在恢復(fù)的過(guò)程中出現(xiàn)了不同程度的枯萎，且隨著AgNO3濃度的升高，玻璃化苗的枯萎程度不斷加重。這可能是因?yàn)锳gNO3濃度過(guò)高時(shí)，Ag+可競(jìng)爭(zhēng)性地進(jìn)入葉綠素分子內(nèi)，改變其結(jié)構(gòu)，使其功能喪失，蛋白質(zhì)的合成受到抑制，從而對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生脅迫或毒害作用[16～17]。

黃芩苷是黃芩中最主要的活性物質(zhì)，其含量的高低直接決定黃芩的質(zhì)量。本研究結(jié)果表明，恢復(fù)苗中黃芩苷的含量明顯高于玻璃化苗，卻明顯低于正常苗。此外，黃芩提取物的抗氧化、抗菌、抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明恢復(fù)苗的生物活性相比于玻璃化苗有了顯著地提高，卻仍低于正常苗。黃芩苗中黃芩苷的積累主要受光合作用和可溶性蛋白含量的影響[18～19]。一方面，玻璃化苗中葉綠素的含量較低，植株的光合作用較弱，黃芩苷的合成量較少。另一方面，玻璃化苗體內(nèi)可溶性蛋白含量較低[20]，也限制了黃芩苗中黃芩苷的積累。

綜上所述，AgNO3對(duì)組培玻璃化黃芩苗具有良好的抑制及逆轉(zhuǎn)作用，且恢復(fù)苗中活性物質(zhì)及生物活性較玻璃苗有了顯著地提升，但相比于正常組培苗還有一定的差距。由此我們推測(cè)恢復(fù)苗體內(nèi)活性成分含量恢復(fù)到正常水平所用時(shí)間比其表觀形態(tài)恢復(fù)所用時(shí)間更長(zhǎng)。因此今后的研究我們要對(duì)AgNO3逆轉(zhuǎn)的黃芩玻璃化苗體內(nèi)生物活性成分含量和活性的恢復(fù)需要時(shí)間進(jìn)行研究，為黃芩的組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

4 結(jié)論

AgNO3對(duì)黃芩組培苗的玻璃化現(xiàn)象具有良好的抑制和逆轉(zhuǎn)作用，且最適濃度為4 mg·L-1。在組織培養(yǎng)基中添加AgNO3處理30 d后，恢復(fù)苗的表面形態(tài)恢復(fù)正常，其體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物黃芩苷的積累量和提取物的生物活性和玻璃化苗相比均有顯著的提升，但仍低于正常的組培苗。這說(shuō)明經(jīng)AgNO3逆轉(zhuǎn)的黃芩玻璃化苗體內(nèi)活性成分的含量和活性的恢復(fù)比形態(tài)的恢復(fù)需要更長(zhǎng)的時(shí)間。