楊 賀 張 楠 劉自廣 林建輝 孫世臣 劉圣怡 岑 曦 吳 娟*

(1.東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室，生命科學(xué)學(xué)院，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150028； 3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所，哈爾濱 150028； 4.牡丹江醫(yī)學(xué)院，牡丹江 157011)

非編碼RNA(non-coding RNA,nc RNA)指不翻譯成蛋白質(zhì)的多種RNA(包括rRNA，tRNA，snoRNA，microRNA等)。研究表明非編碼RNA廣泛存在于生物體中，其中人類基因組約2%轉(zhuǎn)錄本具有編碼蛋白質(zhì)的功能，其余大部分轉(zhuǎn)錄本是非編碼RNA。它們可由基因組上任意位點轉(zhuǎn)錄生成[1～3]，通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要生物學(xué)功能。

非編碼RNA根據(jù)序列長度可分為兩種，小于200個核苷酸長度為短非編碼RNA(small no-coding RNA)，包括siRNA、sdRNA、piRNA等。大于200個核苷酸長度為長非編碼RNA(long no-coding RNA,lncRNA)。迄今為止，發(fā)現(xiàn)的長非編碼RNA約有15 000種[4]，大多數(shù)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而來，具有5′帽、poly(A)尾及選擇性剪接位點等結(jié)構(gòu)。研究證實，lncRNA來源于編碼蛋白質(zhì)基因開放閱讀框的更改；染色質(zhì)重組；非編碼序列的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座；局部復(fù)制子的串聯(lián)；轉(zhuǎn)座元件的插入[5]，并參與了蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄前水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、表觀水平調(diào)控等多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控階段。長期以來，研究者對人類及動物長非編碼RNA進(jìn)行了大量研究，但在植物中研究較少，對植物長非編碼RNA功能解析尚不全面，目前，只有少數(shù)植物lncRNA研究較為詳細(xì)。COOLAIR是與植物春化作用有關(guān)的天然反義轉(zhuǎn)錄本，該基因具有多種剪接方式，在植物開花期間，通過抑制植物開花因子FLC的表達(dá)，促進(jìn)植物開花[6]。ASCO與擬南芥?zhèn)雀纳L發(fā)育有關(guān)，通過對可變剪接調(diào)節(jié)因子的攔截，調(diào)控NSR和ASCO可變剪接模式，影響側(cè)根生長[7]。Npc48通過影響miRNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，影響擬南芥開花時間，其過表達(dá)植株有明顯的葉鋸齒，且其開花時間也明顯推遲[8～9]。LDMAR與水稻花粉形成有關(guān)，降低LDMAR表達(dá)量，引起花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡，從而影響水稻長日照條件下花粉的正常發(fā)育[10]。Zm401與玉米花粉特異性表達(dá)有關(guān)，通過影響花粉發(fā)育相關(guān)基因(ZmMADS2、MZm3-3)的表達(dá)，影響幼花藥小孢子與絨氈層發(fā)育[11～12]。At4(AtIPS1)參與調(diào)節(jié)磷酸鹽饑餓條件下擬南芥根對磷酸鹽的攝取，研究發(fā)現(xiàn)，磷脅迫下誘導(dǎo)擬南芥根和莖中At4基因的表達(dá)[13]。

甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL. var.capitata)是十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬(Brassica)植物，含有雙拷貝的9個CC型基因組，包括花椰菜、結(jié)球甘藍(lán)、西蘭花等蔬菜，在人類飲食中占有重要地位。結(jié)球甘藍(lán)是甘藍(lán)中的一個變種，富含纖維、多種維生素和礦質(zhì)元素等，具有消炎及抗癌作用。目前，甘藍(lán)中只有少數(shù)非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)。宋江華等[14]通過PCR擴(kuò)增方法從結(jié)球甘藍(lán)中克隆出具有明顯非編碼RNA基因序列特征的BcMF11同源基因BoNR1(798 bp)，實驗結(jié)果表明，BoNR1在結(jié)球甘藍(lán)花藥中特異表達(dá)，可能參與調(diào)控花粉發(fā)育過程。Wang等[15]從甘藍(lán)中發(fā)現(xiàn)了193個miRNA，這些miRNA可能調(diào)控了186個代謝途徑，包括脂質(zhì)、能量、淀粉、糖類、脂肪酸和氮等代謝過程。Tian等[16]發(fā)現(xiàn)西蘭花中81個鹽應(yīng)激miRNA，它們的靶基因與新陳代謝和細(xì)胞功能相關(guān)，這些miRNA在調(diào)控鹽脅迫過程中，具有不可或缺的作用。Lukasik等[17]獲得了結(jié)球甘藍(lán)葉子中261個保守的潛在miRNA候選基因，它們可能參與了糖酵解、甘油脂代謝、類黃酮生物合成和氧化磷酸化等重要途徑。

前期研究中，我們根據(jù)RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄活性及其轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA基因結(jié)構(gòu)特征，對擬南芥基因組進(jìn)行計算檢索，發(fā)現(xiàn)了RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄的低氧應(yīng)激應(yīng)答型AtR8 lncRNA[18]；運用invotro轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)與生化分析相結(jié)合的方法，我們發(fā)現(xiàn)了結(jié)球甘藍(lán)中RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄的AtR8 lncRNA同源物BoNR8 lncRNA(272nt)，其于結(jié)球甘藍(lán)萌發(fā)種子根伸長區(qū)表皮層大量表達(dá)；擬南芥中BoNR8 lncRNA過表達(dá)影響了正常種子萌發(fā)、幼苗根生長和角果生長；鹽應(yīng)激及ABA應(yīng)激下，BoNR8 lncRNA通過調(diào)節(jié)萌發(fā)相關(guān)ABA信號經(jīng)路重要基因(RAV1、ABI3、ABI5)表達(dá)，降低了擬南芥萌發(fā)種子耐鹽性及ABA不敏感性[19]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，BoNR8 lncRNA響應(yīng)低溫脅迫環(huán)境；低溫應(yīng)激下，BoNR8 lncRNA過表達(dá)降低了擬南芥種子萌發(fā)。BoNR8 lncRNA低溫相關(guān)功能的發(fā)現(xiàn)為植物耐低溫研究提供了新材料，豐富了植物耐低溫作用機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1.1 植物材料

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana,Columbia)種子，來源于：東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源與環(huán)境研究中心。結(jié)球甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.)種子購于黑龍江省農(nóng)科院蔬菜研究所。BoNR8 lncRNA過表達(dá)植株，通過農(nóng)桿菌浸花法侵染野生型擬南芥植株花序，卡那霉素和Northern blot篩選出獨立3株BoNR8 LncRNA過表達(dá)植株，將純合T3代植物用于實驗分析。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物培養(yǎng)基的配制

(1)1/2Ms培養(yǎng)基。稱取2.37 g·L-1Ms粉，3%(w/v)蔗糖，1 m·L-1KOH調(diào)pH至5.7～5.8，0.8%(w/v)瓊脂粉，120℃高溫高壓滅菌20 min。

(2)0.1 mm·L-1Na2WO4培養(yǎng)基。稱取2.37 g·L-1Ms粉，3%(w/v)蔗糖，0.1 mm·L-1Na2WO4，1 m·L-1KOH調(diào)pH至5.7～5.8，0.8%(w/v)瓊脂粉，120℃高溫高壓滅菌20 min。

1.2.2 冷應(yīng)激應(yīng)答處理

結(jié)球甘藍(lán)種子經(jīng)0.5%次氯酸鈉和70%酒精(V/V)表面消毒、滅菌水洗4次后播種于1/2 Ms培養(yǎng)基上，吸脹48 h(4℃/暗)后轉(zhuǎn)移到10℃培養(yǎng)箱(型號：HWS-250，智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱)中，低溫處理18 h。

1.2.3 RNA提取方法

0.1 g結(jié)球甘藍(lán)種子于液氮中徹底研磨后加入1 mL RNA提取液{45.5%(V/V)苯酚，9%(V/V)氯仿，0.45%(W/V)SDS，41 mm·L-1LiCl，2 mm·L-1EDTA，5.9 mm·L-1β-巰基乙醇，82 mm·L-1Tris-HCl}，離心取上清液并加入等體積PCI溶液(苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1)，離心取上層溶液，加入等體積氯仿，離心取上層溶液并加入1/3體積8 m·L-1LiCl，于-20℃靜置一晚；第二日離心取上層溶液，加入1/4體積異丙醇，于-20℃靜置30 min；離心取上層溶液并加入3/5體積異丙醇，-20℃靜置30 min；離心得到RNA沉淀經(jīng)75%(V/V)乙醇(DEPC水配制)洗滌后，加入適量DEPC水溶解，于-80℃中保存。

1.2.4 Northern blot

5 μg RNA經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，與Dig標(biāo)記的AtR8 RNA變性探針過夜雜交。次日，將雜交后的膜放入含0.1% SDS(W/V)的2×SSC及0.2×SSC溶液中室溫清洗2次，放入1.5% blocking(W/V)溶液中封閉1 h，與3 000倍稀釋的Anti-Digoxigenin-AP抗體反應(yīng)2 h?？贵w反應(yīng)結(jié)束后，馬來酸洗液(含Tween 20)室溫洗膜3次。膜與檢測液(pH9.5)中CDP-Star暗處反應(yīng)15 min后，于LAS-4000檢測，Multi-Gauge對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 種子萌發(fā)率統(tǒng)計

我們將飽滿的野生型、BoNR8 lncRNA過表達(dá)Bo1#、2#、3#擬南芥種子各30粒分別點在1/2Ms、0.1 mmol·L-1Na2WO4培養(yǎng)基上，吸脹處理72 h后(4℃/暗)，分別放入22℃培養(yǎng)箱(型號：PRX-450智能人工氣候箱)以及10℃低溫培養(yǎng)箱(型號：HWS-250智能恒溫恒濕箱)中，16 h光照/8 h黑暗進(jìn)行培養(yǎng)，統(tǒng)計1～7 d萌發(fā)情況。每個實驗重復(fù)3次，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoNR8 lncRNA序列中冷應(yīng)激單元的發(fā)現(xiàn)

Di等通過RNApromo數(shù)據(jù)庫預(yù)測和描述了相同功能中l(wèi)nc RNA的保守基序，發(fā)現(xiàn)了富含AU的莖環(huán)(AUC=0.948，P<0.001)響應(yīng)冷應(yīng)激，該基序(AGAGAAAGAAAG)在植物物種中是進(jìn)化保守的，可以被其他調(diào)節(jié)因子(例如RNA結(jié)合蛋白)識別[20]。通過BLAST序列比對，我們發(fā)現(xiàn)BoNR8 lncRNA轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)存在冷應(yīng)激單元(ATATAAATAAAT)，序列相似性達(dá)(67%，8/12)(圖1A)。這個冷應(yīng)激單元位于RNAlogo預(yù)測的BoNR8 lncRNA(rnalogo.mbc.nctu.edu.tw)莖環(huán)相連二級結(jié)構(gòu)中的最大環(huán)狀結(jié)構(gòu)中(圖1B)，這表明BoNR8 lncRNA可能響應(yīng)低溫脅迫。

2.2 結(jié)球甘藍(lán)種子萌發(fā)期BoNR8 lncRNA響應(yīng)低溫脅迫應(yīng)激

前期研究表明，BoNR8 lncRNA在結(jié)球甘藍(lán)種子萌發(fā)期大量表達(dá)[19]。為此，我們提取22℃和10℃處理18 h的結(jié)球甘藍(lán)萌發(fā)種子RNA，與Dig標(biāo)記AtR8 lncRNA特異探針進(jìn)行雜交，調(diào)查了低溫脅迫條件下，結(jié)球甘藍(lán)種子萌發(fā)期BoNR8 lncRNA表達(dá)變化。Northern分析表明，10℃處理18 h后結(jié)球甘藍(lán)萌發(fā)種子中BoNR8 lncRNA明顯被誘導(dǎo)(如圖2所示)。

圖1 BoNR8 lncRNA序列中冷應(yīng)激單元的發(fā)現(xiàn) A.BoNR8 lncRNA序列與冷應(yīng)激單元的序列比較分析(USE、TATA啟動子序列被大寫加粗并加框，BoNR8 lncRNA轉(zhuǎn)錄區(qū)域被大寫并加粗，高度保守序列用星號標(biāo)注)；B.RNAlogo軟件預(yù)測到冷應(yīng)激單元存在BoNR8 lncRNA二級結(jié)構(gòu)最大環(huán)狀結(jié)構(gòu)中(冷應(yīng)激單元被大寫加粗)Fig.1 Secondary structure and sequence characteristics of BoNR8 lncRNA A.Sequence comparison of BoNR8 lncRNA sequence with cold stress unit(The USE and TATA promoter sequences are bolded and framed, the BoNR8 lncRNA transcribed region is capitalized and bolded,and the highly conserved sequence is marked with an asterisk); B.The RNAlogo software predicted that the cold stress unit was present in the largest cyclic structure of the secondary structure of BoNR8 lncRNA(The cold stress unit is capitalized in bold)

圖2 結(jié)球甘藍(lán)種子萌發(fā)期BoNR8 lncRNA響應(yīng)低溫脅迫應(yīng)激 SDS法提取正常培養(yǎng)及10℃處理18 h的結(jié)球甘藍(lán)萌發(fā)種子RNA，Northern結(jié)果顯示，10℃處理18 h后，BoNR8 lncRNA表達(dá)量增加。Fig.2 Expression characteristics of BoNR8 lncRNA in cold-treated cabbage seeds The RNA of germinated seeds of normal culture and 10℃ treatment for 18 h was extracted by SDS method.Northern results showed that the expression of lncRNA in BoNR8 increased after treatment at 10℃ for 18 h.

2.3 低溫脅迫下BoNR8 lncRNA過表達(dá)抑制了擬南芥種子萌發(fā)

為了分析BoNR8 lncRNA功能，我們構(gòu)建了BoNR8 lncRNA過表達(dá)載體，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對擬南芥野生型植株花序進(jìn)行侵染，篩選得到T3代純合過表達(dá)植株(Bo1#、2#、3#)[19]，Northern結(jié)果表明，在Bo1#、2#、3#中，BoNR8 lncRNA被大量誘導(dǎo)(圖3A)。我們分析了10℃低溫條件下野生型Wt與Bo1#、2#、3#的萌發(fā)率。實驗結(jié)果表明，1/2Ms培養(yǎng)基22℃培養(yǎng)條件下，Bo1#、2#、3#的萌發(fā)率低于野生型，這說明BoNR8 lncRNA影響種子的萌發(fā)(圖3B)。低溫處理同時抑制了野生型和Bo1#、2#、3#種子萌發(fā)，但對Bo1#、2#、3#抑制作用更強(qiáng)(圖3B)。

ABA(脫落酸)是一種重要的植物激素。通常應(yīng)激環(huán)境會導(dǎo)致植物體內(nèi)ABA積累并抑制種子萌發(fā)。為此我們在培養(yǎng)基中加入鎢酸鈉(Na2WO4,ABA合成抑制劑)，調(diào)查了低溫條件下Bo1#、2#、3#低萌發(fā)率是否與萌發(fā)種子體內(nèi)ABA積累相關(guān)。實驗表明，10℃低溫處理條件下，添加鎢酸鈉并沒有改變Bo1#、2#、3#的萌發(fā)趨勢(圖3B)，與低溫、1/2Ms培養(yǎng)條件下萌發(fā)率趨勢一致(圖3B)，這說明低溫抑制Bo1#、2#、3#萌發(fā)與萌發(fā)種子體內(nèi)ABA含量變化無關(guān)。

3 討論

低溫是植物生長發(fā)育過程中普遍遇到的自然環(huán)境，限制植物的生長和發(fā)育，影響植物在自然界中的地理位置。低溫可導(dǎo)致農(nóng)作物凍傷，降低農(nóng)作物產(chǎn)量，影響農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)植物遇到低溫脅迫后，可以激發(fā)一系列細(xì)胞反應(yīng)及應(yīng)激途徑，使植物適應(yīng)低溫脅迫，實現(xiàn)自身生命活動， 了解植物如何轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)冷信號一直是研究熱點。遺傳及分子研究已證實，CBF信號徑路在低溫脅迫中起到重要作用[21]，植物可通過激素如乙烯、茉莉酸等，協(xié)調(diào)CBF信號徑路以適應(yīng)低溫脅迫。乙烯對植物抵抗低溫脅迫具有積極作用，Shi等[22]發(fā)現(xiàn)，EIN3是參與乙烯信號徑路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過結(jié)合EIN3啟動子中EBS基序，影響CBF的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控擬南芥低溫耐受性。茉莉酸可調(diào)節(jié)ICE蛋白轉(zhuǎn)錄活性及CBF1的表達(dá)，正向調(diào)控CBF信號[23]。近期研究表明，大量miRNA參與調(diào)節(jié)植物低溫脅迫過程，如miR394、miR397等。miR394對CBF信號徑路具有正向調(diào)節(jié)作用，低溫條件下，miR394過表達(dá)植株中，CBF1、CBF2和CBF3被大量誘導(dǎo)[24]。miR397也被證實可提高植物低溫耐受性，4℃下，野生型植株停止生長，而miR397過表達(dá)植株可存活兩個月[25]。目前研究尚未證實lncRNA是否參與調(diào)控CBF信號徑路，對于lncRNA參與低溫脅迫的作用機(jī)制尚不清晰，有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。

圖3 低溫脅迫下BoNR8 lncRNA過表達(dá)抑制了擬南芥種子萌發(fā) A.SDS法提取Wt、1#、2#、3#植株RNA，Northern結(jié)果顯示，在Bo1#、2#、3#中，BoNR8 lncRNA被大量誘導(dǎo)；B.不同實驗條件下，野生型和Bo1#、2#、3#萌發(fā)率分析Fig.3 Overexpression of BoNR8 lncRNA inhibits Arabidopsis seed germination under low temperature stress A.Wt,1#,2# and 3# plant RNA were extracted by SDS method,Northern results showed that BoNR8 lncRNA was induced in a large amount in Bo1#,2# and 3#; B.The germination rate of wild type and Bo1#,2#,3# was analyzed under different experimental conditions

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)BoNR8 lncRNA序列中存在冷應(yīng)激單元，且其存在二級結(jié)構(gòu)中最大莖環(huán)處。低溫脅迫誘導(dǎo)結(jié)球甘藍(lán)種子中BoNR8 lncRNA的表達(dá)，且BoNR8 lncRNA過表達(dá)抑制擬南芥種子萌發(fā)。進(jìn)一步實驗表明，低溫對BoNR8 lncRNA的影響，與ABA信號徑路關(guān)聯(lián)不大。本研究初步證明，lncRNA對于植物抵抗低溫環(huán)境可能具有重要的意義，其中，BoNR8 lncRNA參與調(diào)節(jié)低溫脅迫，可能影響種子萌發(fā)，幼苗發(fā)育等重要生命過程。

眾所周知，低溫對植物的生長、發(fā)育有著重要的影響，可以直接影響農(nóng)作物的質(zhì)量和產(chǎn)量，甘藍(lán)是重要的經(jīng)濟(jì)作物，培育甘藍(lán)耐低溫品種，有著特殊的經(jīng)濟(jì)意義。目前，與低溫脅迫相關(guān)的lncRNA還沒有被大量報道，BoNR8 lncRNA研究為植物低溫研究提供了新材料，為低溫脅迫作用機(jī)制分析提供新的實驗思路，有助于從植物長非編碼RNA的角度闡述未清晰生理功能。今后我們將通過篩選結(jié)球甘藍(lán)中缺失突變體等植物材料，結(jié)合過表達(dá)植株，進(jìn)一步探究BoNR8 lncRNA與哪些低溫脅迫的調(diào)節(jié)基因相關(guān)，這將對植物生長發(fā)育、遺傳育種、抗病抗逆等方面具有重要意義。