鐘潔，陶寧，趙利，何誠，胡建平

過敏性哮喘是一種慢性炎性氣道疾病，由多種炎性細(xì)胞介導(dǎo)發(fā)生，全世界大約有3.5億過敏性哮喘患者，每年增加速率大約為3%，發(fā)病率逐年上升[1]。過敏性哮喘發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年研究發(fā)現(xiàn)[2]，輔助性Th17細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在哮喘發(fā)病中占有重要地位。細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白(SOCS)家族是一類反饋性阻斷細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的調(diào)節(jié)因子，由細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，SOCS-1、SOCS-3是SOCS家族中重要的2種分子[3-4]。T細(xì)胞亞群在免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，SOCS-1、SOCS-3可通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群分化影響不同類型的免疫應(yīng)答。研究表明[7]，SOCS-1、SOCS-3可被多種炎性因子和抗炎因子誘導(dǎo)表達(dá)，在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用。研究顯示，Th17參與多種炎性疾病及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性關(guān)節(jié)炎等[8]。體內(nèi)炎性因子的異常波動(dòng)可能會引起Th17/Treg比例失衡，臨床上對于Th17/Treg失衡在過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展中的意義鮮有研究報(bào)道?，F(xiàn)檢測過敏性哮喘患者外周血SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)水平，并分析其與Th17/Treg失衡的關(guān)系及意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年4月—2019年9月四川省遂寧市中心醫(yī)院急診科診治過敏性哮喘患者60例為哮喘組，男 31例，女29例，年齡22～54(38.15±8.23)歲；病程1～10(2.05±1.02)年；哮喘程度，輕度32例，中重度28例；患者無家族遺傳史，無其他慢性病史。選取同期醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康體檢者60例作為健康對照組，男30例，女30例，年齡24～56(39.01±8.57)歲，均經(jīng)皮膚過敏原點(diǎn)刺試驗(yàn)為陰性，且無過敏性疾病及其他慢性疾病史，無長期用藥史，近1周內(nèi)無急性感染情況。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合過敏性哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)者，哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)參照全球哮喘防治創(chuàng)議(global initiative for asthma，GINA)和中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組制定的“支氣管哮喘防治指南(2016年版)”[9]；②皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)結(jié)果粉塵螨、戶塵螨陽性者，血清特異性IgE檢測結(jié)果為陽性(血清總IgE>200 U/ml)；③無其他心血管系統(tǒng)疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病等基礎(chǔ)疾??；④取血4周內(nèi)未使用過糖皮質(zhì)激素、肝素、免疫抑制劑或其他影響試驗(yàn)結(jié)果的藥物；⑤1周內(nèi)無急性感染，無過敏性疾病、其他慢性病史。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①非過敏性哮喘患者；②皮膚過敏原點(diǎn)刺試驗(yàn)或血清過敏原特異性抗體均為陰性者；③患有免疫系統(tǒng)疾病者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 樣品制備：無菌條件下抽取2組受試者空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血5 ml， 其中3 ml加入無菌肝素(20 IU/ml)抗凝管，使用密度梯度離心法對外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離；2 ml直接離心取血清，用于 ELISA檢測。

1.3.2 Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞百分率檢測：在測試管、對照管中加入外周血單個(gè)核細(xì)胞，RPMI-1640稀釋后，加入PMA和BFA二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，使用抗人CD4-FITC、IL-17A PE孵育檢測Th17細(xì)胞百分率的樣品， CD25-PE孵育檢測Treg細(xì)胞百分率的樣品；對照管使用MouseIgG1-PE孵育進(jìn)行對照。使用PBS緩沖液反復(fù)洗滌后放入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測[Attune NxT款流式細(xì)胞儀，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，CD4+T細(xì)胞設(shè)門，分析門中CD4+IL-17+T細(xì)胞(Th17細(xì)胞)百分率、CD4+CD25+陽性T細(xì)胞百分率。

1.3.3 SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)水平檢測： 采用RNA提取試劑盒(購自北京天根生化有限公司)提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用定量PCR儀(CFX96型qRT-PCR儀，購自美國Bio-Rad公司)對SOCS-1、SOCS-3 mRNA進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系共10 μl，miScript SYBR?Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反應(yīng)條件：95℃ 90 s，95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)，AceQ qPCR SYBR?Green Mix試劑盒購自南京vazyme生物公司。SOCS-1、SOCS-3 mRNA及內(nèi)參GAPDH的引物序列見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。采用2-△△CT法對血清SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 血清炎性因子水平檢測： 采用酶聯(lián)免疫法測定(ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，購自美國Bio-Tek公司)血清白介素-6(IL-6)、IL-17、IL-23、人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、干擾素(IFN-γ)水平，檢測操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。IL-6 ELISA試劑盒購自Sinobiological公司；IL-17、IL-23、TGF-β1 ELISA試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；IFN-γ試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；為控制檢測質(zhì)量，本次研究所有樣品的檢測均由檢驗(yàn)科同一批人員在同臺儀器上操作，每個(gè)樣本均設(shè)3次重復(fù)。

1.3.5 肺功能檢測: 選擇肺功能檢測儀對所有受試者進(jìn)行肺功能檢測，檢測指標(biāo)包括最大呼吸第1 s呼出氣量(FEV1)、用力肺活量(FVC)、第1 s用力呼吸容積比值(FEV1%)FEV1/FVC。

2 結(jié) 果

2.1 2組外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比值比較 哮喘組外周血Th17細(xì)胞百分率、Th17/Treg比值顯著高于健康對照組(P<0.01)，Treg細(xì)胞百分率顯著低于健康對照組(P<0.01)，見表2。

表2 2組外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比較

2.2 2組外周血單個(gè)核細(xì)胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)水平比較 哮喘組外周血單個(gè)核細(xì)胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)水平高于健康對照組 (P<0.01)，見表3。

表3 2組外周血單個(gè)核細(xì)胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 2組血清炎性因子水平比較 與健康對照組比較，哮喘組血清IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，IFN-γ表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，見表4。

表4 2組炎性因子水平比較

2.4 2組肺功能比較 哮喘組患者FEV1、FVC、FEV1%均顯著低于健康對照組(P<0.01)，見表5。

表5 2組肺功能比較

2.5 SOCS-1、SOCS-3 mRNA與Th17/Treg、炎性因子水平相關(guān)性分析 過敏性哮喘患者SOCS-1、SOCS-3 mRNA與Th17/Treg比值呈正相關(guān)(r=0.488、0.606，P<0.05)，見圖1、圖2； SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)水平均與IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1水平呈正相關(guān)(P<0.01)，與IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；SOCS-3 mRNA水平與SOCS-1 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.471，P<0.01)，見表6。

圖1 SOCS-1 mRNA與Th17/Treg比值相關(guān)性分析

圖2 SOCS-3 mRNA與Th17/Treg比值相關(guān)性分析

表6 SOCS-1、SOCS-3 mRNA與炎性細(xì)胞因子水平相關(guān)性分析

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，過敏性哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)水平相對于健康對照組顯著上調(diào)，提示SOCS-1、SOCS-3可能與過敏性哮喘發(fā)病有關(guān)，其中SOCS蛋白是天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵的生理性調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育和分化、抑制細(xì)胞因子信號通路等，在免疫性疾病、感染性疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用[10-13]。有學(xué)者研究認(rèn)為[14]，SOCS-1通過SH2結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞因子受體胞內(nèi)段Janus激酶(JAK)結(jié)合，使之泛素化后降解，從而阻滯INF-γ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12等多種細(xì)胞因子的信號經(jīng)STAT途徑傳導(dǎo)。SOCS-1缺陷小鼠表現(xiàn)出T細(xì)胞大量激活的劇烈炎性反應(yīng)[15]。因此，SOCS-1被認(rèn)為是防止自身免疫的重要調(diào)節(jié)分子。夏家露等[16]研究發(fā)現(xiàn)，SOCS-3 mRNA表達(dá)水平下調(diào)的小鼠體內(nèi)IL-4水平減少，提示IL-4水平受SOCS-3 mRNA表達(dá)水平調(diào)節(jié)，二者與過敏性哮喘發(fā)生有關(guān)。說明SOCS-1、SOCS-3可能與過敏性哮喘的發(fā)病有關(guān)，推測其主要是通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化及抑制細(xì)胞因子信號通路而發(fā)揮作用。

長期以來的觀點(diǎn)認(rèn)為，Th1/Th2失衡在過敏性哮喘中有重要作用，近年來發(fā)現(xiàn)Th17/Treg失衡在過敏性哮喘中作用同樣突出[17]。Treg不同于Th1/Th2，它可以表現(xiàn)出免疫抑制功能。初始CD4+T細(xì)胞在IL-12和IFN-γ誘導(dǎo)下分化為Th1細(xì)胞，參與細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答；在TGF-β單獨(dú)誘導(dǎo)下分化為Treg細(xì)胞，分泌TGF-β，參與免疫調(diào)節(jié)；在TGF-β和IL-6的共同誘導(dǎo)下分化為Th17，分泌IL-6和IL-17，參與炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病[18]，IL-6可促進(jìn)活化的CD4+細(xì)胞向Th17分化，形成正反饋。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組血清中IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1表達(dá)水平顯著升高，IFN-γ表達(dá)水平顯著降低，哮喘組Th17細(xì)胞百分率、Th17/Treg比值顯著高于健康對照組，Treg細(xì)胞百分率顯著低于健康對照組，提示Th17、Treg細(xì)胞百分率的變化和比例與過敏性哮喘有關(guān)。而有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[19-20]，IL-6能促進(jìn)急性期蛋白合成，介導(dǎo)前列腺素合成，從而參與哮喘的炎性反應(yīng)。IL-17是一種促炎性細(xì)胞因子，可作用于氣道上皮細(xì)胞等炎性細(xì)胞，通過刺激趨化因子、細(xì)胞炎性因子等促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞募集引發(fā)炎性反應(yīng)[21]。李小明[22]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者支氣管活檢標(biāo)本IL-17水平較健康者高，且與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，提示IL-17參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。洪菲萍等[23]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過治療后支氣管哮喘急性發(fā)作患兒病情顯著好轉(zhuǎn)，血清中IFN-γ水平顯著升高，IFN-γ有助于支氣管哮喘的診斷及病情變化的判斷。Yan等[24]研究發(fā)現(xiàn)，過敏性哮喘患者外周血IL-17水平較健康對照組表達(dá)增加，說明IL-17可能在哮喘初期或疾病進(jìn)展期間發(fā)揮作用，但其作用尚未確定。Guerra等[25]研究發(fā)現(xiàn)，IL-23在過敏性哮喘等免疫類疾病中發(fā)揮重要作用。Chu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在哮喘組血清中水平高于健康對照組，可能與難治性哮喘發(fā)生有關(guān)。本研究與以往研究結(jié)果相似，提示過敏性哮喘患者存在不同程度炎性反應(yīng)，可能與Th17/Treg失衡有關(guān)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過敏性哮喘患者外周血SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)水平與IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1呈正相關(guān)，與IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)；SOCS-1、SOCS-3 mRNA與Th17/Treg比值呈正相關(guān)，提示SOCS-1、SOCS-3 mRNA可能通過對細(xì)胞因子的調(diào)控影響Th17、Treg的細(xì)胞數(shù)量從而影響Th17/Treg比值。

綜上所述，過敏性哮喘患者外周血中存在SOCS-1、SOCS-3 mRNA高表達(dá)，以Th17細(xì)胞比率上升為主的Th17/Treg失衡，且過敏性哮喘患者SOCS-1、SOCS-3 mRNA高表達(dá)與Th17/Treg失衡有關(guān)。但本研究樣本量不充分，需要擴(kuò)大樣本量對SOCS-1、 SOCS-3 mRNA在過敏性哮喘患者Th17/Treg失衡中的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

鐘潔：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；陶寧：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；趙利：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；何誠：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；胡建平：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫