王 聰,謝 磊,董雪瑞,楊雨萱,鄭思躍

(杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 臨江學(xué)院,杭州310018)

溫郁金[1]又名溫莪術(shù)、黑郁金,為姜黃屬郁金的栽培品種。將溫郁金的塊根洗凈,上籠蒸后曬干,即為溫郁金;根莖洗凈后,除去須根及糙皮,蒸熟后曬干為溫莪術(shù);將根莖洗凈后,用刀縱切成薄片,直接曬干為片姜黃。溫郁金是一種可加工成3種中藥飲片的藥材,其主產(chǎn)區(qū)為浙江瑞安,氣微香,味微苦,具有活血止痛,行氣解郁,清心涼血,利膽退黃功效。根莖揮發(fā)性成分主要為倍半萜醇和倍半萜烯等活性物質(zhì)[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明,溫郁金具有良好的抗癌作用,對(duì)于癌癥研究具有很大的貢獻(xiàn)[4-5]。

中藥整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系應(yīng)該建立在中藥指紋學(xué)體系的基礎(chǔ)上,中藥指紋學(xué)體系是一種以整體性、特征性、穩(wěn)健性、有效性和安全性為核心的研究中藥的全新學(xué)科體系。中藥指紋信息學(xué)為核心處理技術(shù)和關(guān)鍵方法,是揭示中藥指紋所表達(dá)的化學(xué)物質(zhì)信息、生物活性與藥效信息、藥代動(dòng)力學(xué)和藥劑學(xué)信息以及相關(guān)測(cè)試技術(shù)條件與方法等綜合信息的科學(xué)。中藥整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的出發(fā)點(diǎn)要立足于中藥指紋學(xué)的思路和方法,從全新視角控制中藥質(zhì)量[6]。溫郁金為“浙八味”之一,具有較強(qiáng)的地域?qū)傩?有關(guān)溫郁金指紋圖譜研究報(bào)道中,大多采用高效液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10-12]和光譜法[13-14]等分析方法,均為溫郁金的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了較好的參考。但其采用的前處理方法,如水蒸氣蒸餾法、浸泡法、超聲溶劑萃取法等,均存在過程復(fù)雜、損失較大、受基質(zhì)影響等問題。

超臨界流體是指溫度、壓力均高于自身臨界狀態(tài)的流體,其黏度和擴(kuò)散系數(shù)與氣體相接近,而密度和溶劑化能力卻與液體相接近。超臨界流體萃取技術(shù)(SFE)為國際上最先進(jìn)的物理萃取技術(shù),能最大限度保持天然產(chǎn)物的活性,提高產(chǎn)物的提取率與產(chǎn)品的純度,具有安全無毒副作用、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn),該技術(shù)在天然產(chǎn)物加工中的應(yīng)用日益廣泛。系統(tǒng)聚類的基本思想是將n個(gè)樣品或變量看成n個(gè)分類,然后將距離接近(樣品聚類)或性質(zhì)接近(變量聚類)的兩類合并為一類,再從n－1類中繼續(xù)尋找最接近的兩類合并一類,如此繼續(xù),最終將所有類別合并為一支[15]。筆者已經(jīng)應(yīng)用SPSS軟件系統(tǒng)聚類分析比較了不同產(chǎn)地鐵皮石斛的裂解氣相指紋圖譜[16]和不同產(chǎn)地菊花的頂空-固相微萃取-氣相色譜(HS-SPME-GC)指紋圖譜[17]。錢華麗等[18]采用SFE萃取溫郁金中的揮發(fā)性成分,優(yōu)化萃取條件為55℃、35 MPa、240 min,并采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行定性及半定量分析,與水蒸氣蒸餾工藝相比,SFE的回收率較之高出3倍,萃取時(shí)間縮短4倍,抗癌有效活性成分含量更高。與此文獻(xiàn)比較,本工作在SFE萃取過程中具有較多優(yōu)勢(shì):采用的樣品量更少,只需要30 g,而文獻(xiàn)中需要300 g樣品量;采用了動(dòng)-靜態(tài)聯(lián)合萃取法,物料在CO2中能夠更充分的浸潤,氣流的方向多樣化同時(shí)也更節(jié)約氣流,總萃取時(shí)間(靜態(tài)萃取時(shí)間30 min和動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間90 min)為120 min,時(shí)間更少。采用正交試驗(yàn)對(duì)SFE萃取條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化的條件略有不同,這與采用的儀器密切相關(guān)。本工作收集了14批溫郁金樣品,采用SFE-GC-MS建立了其指紋圖譜,指認(rèn)其特征峰,總離子流色譜圖與NIST 14譜庫比對(duì),并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)共有峰進(jìn)行定性,采用系統(tǒng)聚類分析法對(duì)不同產(chǎn)地的14批溫郁金的SFE-GC-MS指紋圖譜進(jìn)行分類比較,最后利用指紋圖譜對(duì)2個(gè)市售溫郁金產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

7890A/5975C型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;7890A型氣相色譜儀,配氫火焰離子化檢測(cè)器(FID);SFE-2ASI型超臨界萃取儀;CP 224S型分析天平;SRA10N-50型凍干機(jī);FW 177型中草藥粉碎機(jī);SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。

14批溫郁金樣品均由某溫郁金合作社提供,具體信息見表1。從藥材市場(chǎng)購買2批溫郁金樣品(U1、U2)作為待測(cè)樣品。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 HP-5ms石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);進(jìn)樣口溫度為280℃;不分流進(jìn)樣;載氣為氦氣,流量為1.0 mL·min－1。柱升溫程序:初始溫度為50℃;以15℃·min－1的速率升溫至155℃,保持1 min;再以2℃·min－1的速率升溫至220℃,保持5 min。

表1 溫郁金樣品信息Tab.1 Information of the wenyujin samples

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI),電離能量為70 eV;離子源溫度為230℃;質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍50～650;傳輸線溫度為280℃。

1.3 試驗(yàn)方法

將溫郁金洗凈、瀝水后冷凍干燥36 h,用研缽磨碎,用中藥網(wǎng)篩篩取顆粒直徑小于0.425 mm的粉末樣品。稱取樣品30 g于10 mL萃取釜內(nèi),將萃取釜置于加熱箱內(nèi),連接萃取釜接口,關(guān)上箱門。調(diào)節(jié)萃取溫度為35℃,溫度達(dá)到設(shè)定值時(shí),設(shè)定壓力為15 MPa。當(dāng)溫度和壓力均到達(dá)設(shè)定值時(shí),進(jìn)行靜態(tài)萃取并開始同步計(jì)時(shí)(注意要關(guān)閉出口閥),靜態(tài)萃取時(shí)間為30 min。靜態(tài)萃取結(jié)束,同時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)萃取,回收萃取液。在回收瓶?jī)?nèi)加入5 mL甲醇,并將出口針沒入甲醇中。打開出口閥,調(diào)節(jié)微量閥,設(shè)置CO2氣體流量為800 mL·min－1,開始動(dòng)態(tài)回收萃取液。氣動(dòng)泵可將萃取釜內(nèi)壓力保持在設(shè)定值區(qū)間內(nèi),動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為40 min。按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算溫郁金精油得率,具體見公式(1):

式中:w為溫郁金精油得率;m2為精油的質(zhì)量,g;m1為溫郁金的質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)

分別對(duì)萃取溫度(A)、萃取壓力(B)、靜態(tài)萃取時(shí)間(C)、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間(D)進(jìn)行單因素試驗(yàn),以溫郁金精油得率為考察指標(biāo),采用L9(34)正交試驗(yàn)表,對(duì)萃取溫度(30,35,40℃)、萃取壓力(10,15,20 MPa)、靜態(tài)萃取時(shí)間(20,30,40 min)、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間(60,90,120 min)等4個(gè)因素在3個(gè)不同水平上按照L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn),結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the orthogonal test

由表2可知:各因素對(duì)超臨界CO2萃取溫郁金中的精油得率的影響順序?yàn)?萃取溫度＞動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間＞萃取壓力＞靜態(tài)萃取時(shí)間。最佳萃取條件為A2B2C2D2,即萃取溫度為35℃,萃取壓力為15 MPa,靜態(tài)萃取時(shí)間30 min,動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間90 min。

采用最優(yōu)條件平行萃取5次,溫郁金精油得率平均值為1.29%,該值均高于以上表2中的精油得率,由此驗(yàn)證萃取條件的可靠性。

2.2 色譜行為

2.2.1 溫郁金指紋圖譜的參照峰與共有峰的選擇

按照試驗(yàn)方法對(duì)14批溫郁金樣品進(jìn)行測(cè)定,S3樣品的色譜圖見圖1。

由圖1可知:溫郁金CO2超臨界萃取經(jīng)GCMS分析后,總離子流色譜圖中共有50多個(gè)色譜峰,選擇共有峰作為考察對(duì)象,即保留時(shí)間在40 min內(nèi)的1～26號(hào)色譜峰。14批樣品的共有峰面積分別占總峰面積的85%左右,選擇保留時(shí)間為17.12 min的16號(hào)峰為參考峰,該峰為溫郁金有效成分莪術(shù)二酮、峰強(qiáng)度最強(qiáng)且穩(wěn)定。

2.2.2 溫郁金指紋圖譜的建立

根據(jù)14批溫郁金樣品的色譜圖計(jì)算26個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間α(各組分的調(diào)整保留時(shí)間與峰16的調(diào)整保留時(shí)間的比值)和峰面積百分比S(該組分峰面積占共有峰面積之和的百分比),以及各樣品中26組分的峰面積百分比S之間的最大差值[ΔS(Max)],結(jié)果見表3。

由表3可知:當(dāng)α為0.296～3.342時(shí),S＜10%,ΔS(Max)為0.17%～7.96%,按照文獻(xiàn)[19]要求,當(dāng)S＜10%時(shí),對(duì)ΔS(Max)不作要求。以上的結(jié)果表明:14批溫郁金樣品的SFE-GC-MS的圖譜具有較強(qiáng)的相似性,完全達(dá)到建立指紋圖譜的技術(shù)要求。

圖1 S3溫郁金樣品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of S3 wenyujin sample

表3 14批溫郁金樣品的SFE-GC-MS指紋圖譜數(shù)據(jù)Tab.3 SFE-GC-MS fingerprint data of 14 wenyujin samples

2.2.3 溫郁金化學(xué)成分的質(zhì)譜分析

結(jié)合文獻(xiàn)[10-11,18,20]以及NIST 14譜庫質(zhì)譜分析可知,超臨界萃取溫郁金所得揮發(fā)油基本上為倍半萜烯烴及其氧化衍生化合物。圖1和表3中的峰5、7、13～18為溫郁金中標(biāo)志性揮發(fā)性產(chǎn)物,在抗腫瘤、抗病毒方面發(fā)揮重要作用;峰1～3為單萜類化合物,具有抗氧化、抗菌、祛痰等作用;峰4、6、8～12均為倍半萜類化合物,此類物質(zhì)具有芳香性,氣味濃郁;峰19～24為倍半萜的氧化衍生物,具有芳香性、抗炎性等作用;峰25、26均為脂肪酸。

2.3 溫郁金樣品的系統(tǒng)聚類分析

采用SPSS 16.0軟件包中的系統(tǒng)聚類程序?qū)?6(14批樣品及2個(gè)市售溫郁金待測(cè)樣品)×26階(26個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積)原始數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析。方法上,數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化從－1到1,采用平方歐式距離作為間距測(cè)量變量,樣本間以組間聯(lián)接聚類法進(jìn)行連接,輸出系統(tǒng)聚類譜系圖。

圖2為溫郁金樣品系統(tǒng)聚類譜系圖,橫坐標(biāo)為臨界值,即類間距離,縱坐標(biāo)為樣品來源地。臨界值越小,表示色譜圖相似度越高。

圖2 溫郁金樣品系統(tǒng)聚類譜系圖Fig.2 Hierarchical cluster analysis diagram of curcuma wenyujin samples

由圖2可知:當(dāng)臨界值為9～10時(shí),來源于瑞安市陶山、瑞安市馬嶼、瑞安市南濱分為3類,反映了這3類溫郁金的不同產(chǎn)地來源,瑞安市陶山鎮(zhèn)位于經(jīng)度120°39′,緯度27°47′,瑞安市馬嶼經(jīng)度120°27′,緯度27°47′,瑞安市南濱經(jīng)度120°39′,緯度27°42′。產(chǎn)地的地理位置非常接近,因此受到當(dāng)年的光照、雨水、溫度等方面影響較少,主要受土壤條件和人工種植方式影響較大;當(dāng)臨界值為4～9時(shí),來源于瑞安市陶山鎮(zhèn)沙一村(S1、S2)、二村(S3、S4)、三村(S5、S6)與瑞安市陶山鎮(zhèn)岱下村(S9、S10)、瑞安市陶山鎮(zhèn)樓渡(S14)分為3類,反映了瑞安市陶山鎮(zhèn)溫郁金與其他地方的差別;當(dāng)臨界值為1～4時(shí),各個(gè)產(chǎn)地的溫郁金均能得到清晰的區(qū)分;另外,2個(gè)市售溫郁金樣品U1和U2,經(jīng)此相同系統(tǒng)聚類分析法,可判定為樣品U1產(chǎn)地為瑞安市陶山鎮(zhèn)沙二村,樣品U2產(chǎn)地為瑞安市馬嶼青垟。結(jié)果表明,即使是地域非常接近,系統(tǒng)聚類分析法也能較為全面、綜合地反映不同產(chǎn)地溫郁金SFE-GC-MS譜圖之間的差異,還能對(duì)市售溫郁金樣品進(jìn)行產(chǎn)地鑒別。

本工作建立了SFE-GC-MS分析8個(gè)產(chǎn)地14批溫郁金樣品和2個(gè)市售溫郁金樣品的氣相色譜指紋圖譜,后進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果表明,建立的方法既能反映溫郁金SFE-GC-MS圖譜之間的相似關(guān)系又能反映不同產(chǎn)地的差異,并可對(duì)市售溫郁金進(jìn)行產(chǎn)地鑒別。