李瀟，楊彤，李小兵，趙國(guó)麗，高譽(yù)欣，王浩，牛世英，張?jiān)掠?/p>

1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250200；2山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)；3臨沂市第三人民醫(yī)院

糖尿病腎病(DN)是糖尿病病情進(jìn)展過程中發(fā)生的一種嚴(yán)重的致死性微血管并發(fā)癥，其主要病理變化為腎臟功能和結(jié)構(gòu)的改變，包括腎小球和腎小管肥大、基底膜增厚、足突融合等，后期發(fā)生腎臟不同程度的纖維化，導(dǎo)致腎臟功能喪失，是終末期腎病的主要病因之一[1]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，含21～25個(gè)核苷酸，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控生命體各器官的生物學(xué)功能，在細(xì)胞活性、增殖、炎性反應(yīng)、纖維化等信號(hào)通路中起到重要作用[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-21與多種臟器纖維化關(guān)系密切，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smad通路可影響腎臟間質(zhì)中纖維連接蛋白(FN)、Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)的聚集，從而參與DN纖維化過程。2019年2～11月，我們采用miR-21基因敲除(miR-21 KO)小鼠構(gòu)建DN模型，觀察miR-21基因敲除對(duì)腎臟的保護(hù)作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雄性C57BL/6小鼠20只，體質(zhì)量18～20 g，其中野生型(WT)小鼠10只、miR-21 KO小鼠10只。飼養(yǎng)于SPF標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，自由飲食攝水，環(huán)境溫度18～25 ℃、相對(duì)濕度60%～80%，每日更換墊料、飼料和水。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合山東第一醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 動(dòng)物分組與造模方法 將WT鼠分成WT-Con組、WT-DN組各5只，miR-21 KO鼠分成KO-Con組、KO-DN組各5只。禁食24 h后，WT-DN組、KO-DN組腹腔注射STZ 60 mg/kg(溶解于pH為4.5的檸檬酸緩沖液)，WT-Con組、KO-Con組腹腔注射等量生理鹽水作為對(duì)照。1周后采集尾靜脈血檢測(cè)空腹血糖及尿微量白蛋白、尿肌酐，以空腹血糖≥16.8 mmol、尿微量白蛋白和尿肌酐顯著升高為DN造模成功。

1.3 標(biāo)本采集 造模成功12周后，使用水和氯醛麻醉小鼠，快速灌注4%多聚甲醛進(jìn)行固定。快速剝離雙腎，一側(cè)腎臟置于4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切3 μm厚切片，用于組織病理學(xué)的觀察和免疫組化檢測(cè)；另一側(cè)腎臟用于制作電鏡標(biāo)本，固定在2.5%戊二醛溶液中。

1.4 腎組織病理觀察 采用HE染色。取腎組織切片，二甲苯脫蠟至水，蘇木素浸染10 min;流水沖洗，鹽酸乙醇分化，流水返藍(lán)，伊紅染色5 min;隨后至70%、80%、90%、95%、100%梯度乙醇脫色，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明;樹膠封片,顯微鏡下觀察腎小球和腎小管的病理改變。

1.5 腎臟纖維化程度觀察 采用Masson染色。取腎組織切片，常規(guī)脫蠟至水。取出切片，在重鉻酸鉀-醋酸溶液中浸洗1 h以上除去汞鹽沉淀。蒸餾水洗滌，經(jīng)Masson麗春紅酸性復(fù)紅染液浸染5 min，再用0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，之后用1%磷鉬酸水溶液分化處理3～5 min。直接加入苯胺藍(lán)染色5～10 min，再以0.2%冰醋酸浸洗片刻，95%乙醇及無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察腎臟纖維化改變，重點(diǎn)觀察腎小管間質(zhì)是否出現(xiàn)膠原纖維增多。

1.6 腎組織超微結(jié)構(gòu)觀察 將腎臟組織切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，2.5%戊二醛固定;使用電子透射顯微鏡(日本JEOL公司)掃描，觀察腎小球、腎小管、系膜區(qū)的亞顯微結(jié)構(gòu)改變。

1.7 腎組織TGF-β1、FN、ColⅠ蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取腎組織切片，常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2溶液孵育20 min，加入pH 6.0的檸檬酸鈉緩沖液中，加蓋煮20 min進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加小鼠血清封閉液，37 ℃孵箱中封閉30 min。滴加一抗(TGF-β1稀釋比例為1∶200，F(xiàn)N為1∶500，ColⅠ為1∶100)，4 ℃過夜。PBS沖洗5 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗山羊二抗，37 ℃孵育1 h。PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，流水返藍(lán)。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。顯微鏡下觀察棕黃色陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)部位，并對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比，并觀察免疫反應(yīng)著色強(qiáng)度。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；著色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以兩者積分相乘所得數(shù)值作為蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組腎組織病理學(xué)結(jié)果比較 WT-Con組和KO-Con組腎臟組織腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理變化。WT-DN組和KO-DN組均出現(xiàn)腎小球肥大，腎臟基底膜增厚或薄厚不均一改變，腎小管出現(xiàn)空泡樣改變，偶見腎小管間質(zhì)纖維化及系膜區(qū)有異樣物質(zhì)沉積。與WT-DN組相比，KO-DN組病變改變明顯減輕。

2.2 各組腎組織纖維化程度比較 WT-Con組和KO-Con組腎小球、腎小管及間質(zhì)未見異常膠原增多現(xiàn)象。WT-DN組和KO-DN組腎間質(zhì)可見藍(lán)色膠原纖維，腎小球基底膜不同程度增厚；WT-DN組腎小管間質(zhì)可見大量膠原纖維聚集。與WT-DN組相比，KO-DN組腎小管間質(zhì)纖維化明顯減輕。

2.3 各組腎組織超微結(jié)構(gòu)病理變化 WT-Con組和KO-Con組腎臟基底膜厚度均勻，足細(xì)胞伏于基底膜外側(cè)，胞質(zhì)伸出許多足突，系膜區(qū)由系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)組成。WT-DN組腎臟可見明顯基底膜彌漫性增厚，足細(xì)胞數(shù)量減少，足突間不同程度融合，系膜區(qū)有復(fù)合物沉積。與WT-DN組比較，KO-DN組腎臟超微結(jié)構(gòu)損傷得到緩解，可見基底膜部分增厚，部分足突融合，少量膠原纖維聚集(見圖1)。

圖1 各組腎臟超微結(jié)構(gòu)病理變化(15 000×)

2.4 各組腎組織TGF-β1、FN、ColⅠ蛋白表達(dá)水平比較 與WT-Con組和KO-Con組相比，WT-DN組和KO-DN組腎臟TGF-β1、FN、ColⅠ蛋白表達(dá)水平升高；與WT-DN組相比，KO-DN組TGF-β1、FN、ColⅠ蛋白表達(dá)水平降低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組腎組織TGF-β1、FN、ColⅠ蛋白表達(dá)水平比較

注：與WT-Con組相比，aP<0.05；與KO-Con組相比，bP<0.05；與WT-DN組相比，cP<0.05。

3 討論

DN是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其病理特征伴有嚴(yán)重的微血管病變，是各種慢性腎病所導(dǎo)致的終末期腎病的主要原因，最終會(huì)引發(fā)腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-21與肝臟、肺臟、腎臟的纖維化病變關(guān)系密切[4～8]，但其在DN損傷及腎纖維化中的作用尚存在爭(zhēng)議。Liu等[9～11]報(bào)道，下調(diào)miR-21表達(dá)可減輕腎纖維化進(jìn)展的程度，但具體機(jī)制尚未闡明。然而Zhang等[12]認(rèn)為miR-21對(duì)DN患者可能是一種保護(hù)性因素，早期DN病變過程中miR-21表達(dá)下降，miR-21的表達(dá)有利于抑制系膜細(xì)胞增生，緩解腎臟纖維化過程。因此，有必要進(jìn)一步明確miR-21在DN中的作用及機(jī)制。

本研究采用miR-21 KO小鼠構(gòu)建DN模型，觀察miR-21 KO對(duì)腎臟的保護(hù)作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。HE染色顯示，WT-DN小鼠腎臟出現(xiàn)明顯腎小球肥大，腎小球基底膜改變及系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)增多，而KO-DN小鼠腎臟出現(xiàn)輕微病變，僅表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚，腎小管空泡化。表明miR-21基因缺失可以緩解DN的基本病理改變。進(jìn)一步采用透射電鏡觀察小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)病理變化，發(fā)現(xiàn)WT-DN小鼠腎臟基底膜增厚且厚薄不一，足細(xì)胞足突融合，系膜區(qū)有高密度物質(zhì)沉積，并且有大量腎小管阻塞，幾乎看不到正常的腎小管；而KO-DN小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)病理變化明顯減輕，主要表現(xiàn)為基底膜輕度增厚，部分足突融合，少量高密度物質(zhì)沉積。進(jìn)一步表明miR-21基因缺失可以抑制DN腎損傷。

Masson染色可以觀察組織膠原纖維積聚情況，評(píng)價(jià)纖維化病變程度。本研究結(jié)果顯示，WT-DN小鼠腎間質(zhì)可見藍(lán)色膠原纖維，腎小球基底膜有不同程度增厚；WT-DN小鼠腎小管間質(zhì)可見大量膠原纖維聚集；與WT-DN小鼠比較，KO-DN小鼠腎小管間質(zhì)纖維化明顯減輕。這表明miR-21基因缺失可以減少膠原纖維的沉積,也就是說，miR-21對(duì)于DN是一種不利因素。

TGF-β1廣泛分布于腎小球、腎小管及腎間質(zhì)，可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增生，加強(qiáng)基質(zhì)蛋白的分泌，導(dǎo)致腎小球纖維化及炎癥反應(yīng)[13，14]，被認(rèn)為是致纖維化的重要因子，在DN的發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。DN的早期改變主要是腎小球肥大、系膜細(xì)胞增生、足突融合甚至消失，系膜細(xì)胞進(jìn)一步分泌大量基質(zhì)蛋白如FN、ColⅠ，大量聚集致腎臟纖維化[15]。一方面，TGF-β1可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚集，引起腎小球基底膜增厚，從而加劇腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程；另一方面，TGF-β1介導(dǎo)的Smad通路可以誘導(dǎo)腎間質(zhì)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而引起腎間質(zhì)的纖維化過程[16～18]。杜正馳等[19]報(bào)道，DN患者尿液中FN、ColⅠ水平與TGF-β1呈正相關(guān)，說明TGF-β1可能有刺激FN、ColⅠ在腎小管間質(zhì)增多、聚集的作用。本研究結(jié)果顯示，與與WT-Con組和KO-Con組相比，WT-DN組和KO-DN組腎臟TGF-β1、FN、ColⅠ蛋白表達(dá)水平升高；與WT-DN組相比，KO-DN組TGF-β1、FN、ColⅠ蛋白表達(dá)水平降低。這表明miR-21基因缺失可以緩解DN小鼠的腎臟病變，其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1分子從而減少腎臟基質(zhì)蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，miR-21缺失能夠抑制DN小鼠的腎臟纖維化改變，其機(jī)制可能與調(diào)控腎臟纖維化因子TGF-β1及相關(guān)基質(zhì)蛋白FN、ColⅠ表達(dá)有關(guān)。因此認(rèn)為，miR-21缺失可能對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，有望作為DN纖維化的治療靶點(diǎn)。