馬靜，王凱靖，柴佳，趙丹琿，范林妮，楊重飛，劉一雄

1中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)，西安710032；2中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。近年來，腎細(xì)胞癌的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，其起病隱匿，診斷困難，多數(shù)患者就診時(shí)已延誤最佳治療時(shí)機(jī)，而且腎細(xì)胞癌對(duì)放化療均不敏感，并容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此預(yù)后較差。研究轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(mRCC)惡性進(jìn)展及預(yù)后的相關(guān)分子，對(duì)早發(fā)現(xiàn)、早治療，從而延長患者生存期具有重要價(jià)值。研究顯示，連環(huán)蛋白表達(dá)缺失或減少可能與不同上皮腫瘤的組織學(xué)分級(jí)及腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[1]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)與細(xì)胞膜中的E-鈣黏蛋白(E-cadherin)結(jié)合，在細(xì)胞黏附中起重要作用。新合成的β-catenin通過E-cadherin固定在黏附連接處，并且可以通過在EMT期間下調(diào)E-cadherin而釋放到細(xì)胞質(zhì)中。此外，Wnt途徑的激活導(dǎo)致β-catenin磷酸化水平的降低，也有助于β-catenin的胞質(zhì)內(nèi)積累。β-catenin作為Wnt通路中的關(guān)鍵分子，參與細(xì)胞黏附和細(xì)胞極性的控制[2]，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究通過檢測(cè)β-catenin在mRCC中的表達(dá)，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年2月～2017年3月在我院行手術(shù)切除治療的腎細(xì)胞癌患者58例，男49例、女9例，年齡<60歲27例、≥60歲31例。均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為腎細(xì)胞癌，其中原發(fā)性腎細(xì)胞癌(pRCC)23例，未發(fā)現(xiàn)腎臟及腎外復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶；mRCC 35例，包括骨轉(zhuǎn)移15例、肺轉(zhuǎn)移12例、腦轉(zhuǎn)移3例、軟組織轉(zhuǎn)移4例、膽囊轉(zhuǎn)移1例；Fuhrman分級(jí)1～2級(jí)35例、3～4級(jí)15例。

1.2 β-catenin蛋白檢測(cè)方法 采用免疫組化EnVision兩步法。收集手術(shù)切除的腎細(xì)胞癌組織，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟至水，加入Tris-EDTA進(jìn)行抗原修復(fù)。加入1% H2O2-甲醇作用20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶，加入5% BSA孵育20 min以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入1∶150稀釋的β-catenin一抗(兔抗人單克隆抗體，Proteintech，美國)，4 ℃孵育過夜；PBS漂洗3次，加入EnVision二抗室溫孵育40 min，PBS清洗3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水封固。以同種非免疫動(dòng)物血清及PBS代替一抗分別作為陰性對(duì)照以及空白對(duì)照。陽性染色為表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間隙的棕黃色顆粒。根據(jù)文獻(xiàn)[3]對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞占比≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分；著色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相乘，<2為陰性，≥2為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存時(shí)間曲線，以Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用COX單因素回歸分析β-catenin與患者生存期的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mRCC與pRCC組織中β-catenin表達(dá)比較 mRCC組織中β-catenin表達(dá)陽性23例，陽性率為65.7%；pRCC組織中β-catenin表達(dá)陽性9例，陽性率為39.1%。mRCC組織中β-catenin表達(dá)高于pRCC(χ2=3.966，P=0.046)。

2.2 β-catenin蛋白表達(dá)與mRCC患者臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡mRCC患者β-catenin陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，F(xiàn)uhrman 1～2級(jí)患者β-catenin陽性率高于Fuhrman 3～4級(jí)患者(P=0.019)，不同轉(zhuǎn)移部位mRCC患者癌組織中β-catenin表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)。見表1。

表1 不同臨床病理特征mRCC患者癌組織β-catenin陽性率比較

2.3 β-catenin陽性表達(dá)與mRCC患者預(yù)后的關(guān)系 β-catenin陽性表達(dá)患者的5年總生存率為39.1%(9/23)，5年無進(jìn)展生存率為21.7%(5/23)，低于β-catenin陰性表達(dá)患者的58.3%(7/12)、33.3%(4/12)(P均<0.05)。對(duì)獲得隨訪的33例mRCC患者的生存期進(jìn)行單因素回歸分析，結(jié)果顯示，患者生存期與β-catenin表達(dá)有關(guān)(P=0.042)，與年齡、性別、Fuhrman分級(jí)和轉(zhuǎn)移部位無關(guān)(P均>0.05)。見表2。

表2 mRCC患者生存期的單因素回歸分析結(jié)果

3 討論

腎細(xì)胞癌在臨床上診斷困難，對(duì)放化療不敏感，患者就診時(shí)往往已是終末期階段，需要接受手術(shù)切除或者腎移植治療。因此，尋找與腎細(xì)胞癌早期診斷、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的指標(biāo)對(duì)腎細(xì)胞癌的分子診斷和靶向治療具有重要意義。

Wnt/β-catenin通路在細(xì)胞增殖、分化和誘導(dǎo)凋亡中均有一定的作用。文獻(xiàn)報(bào)道，在宮頸癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、腎細(xì)胞癌等多種癌癥中，Wnt信號(hào)通路均顯著活化[4～8]。作為其重要的下游效應(yīng)因子，β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵介體，在多種生命活動(dòng)過程中都發(fā)揮關(guān)鍵作用。最初發(fā)現(xiàn)β-catenin是以一種細(xì)胞膜連接復(fù)合物的形式，隨后發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中，β-catenin可以作為關(guān)鍵的入核分子，進(jìn)而調(diào)節(jié)下一步的轉(zhuǎn)錄[9]。后來研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞中β-catenin主要以三種形式存在：在細(xì)胞膜上作為黏附蛋白的一部分，以及在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)[10]。同時(shí)，β-catenin的結(jié)構(gòu)和信號(hào)傳導(dǎo)的改變通常與癌癥及其轉(zhuǎn)移相關(guān)。當(dāng)與靶細(xì)胞相互作用時(shí)，在糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的作用下，β-catenin被磷酸化和泛素化。當(dāng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)處于靜息狀態(tài)時(shí)，β-catenin形成由軸蛋白、腺瘤性結(jié)腸息肉(APC)、酪蛋白激酶和GSK-3β組成的復(fù)合物，磷酸化β-catenin。這種磷酸化的β-catenin被β-TrCP泛素化，隨后被蛋白酶體降解[11]。在Wnt配體存在的情況下，包括GSK-3、酪蛋白激酶Iα(CKIα)、Axin和APC蛋白的復(fù)合體募集到Wnt受體復(fù)合物并失活，從而導(dǎo)致泛素化被抑制，新合成的β-catenin得以積累并入核，與淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子和T細(xì)胞因子家族成員相互作用[12]，促進(jìn)控制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵Wnt靶基因如c-myc和細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的轉(zhuǎn)錄。在很多腫瘤中，激活KRAS和BRAF的基因突變可以激活Wnt通路并增加細(xì)胞核中β-catenin的表達(dá)。另有研究證明，β-catenin的過度活化和Wnt通路內(nèi)源性拮抗劑的功能喪失與腎癌的形成和發(fā)展有關(guān)，其中Wnt信號(hào)通路不僅可以通過激活β-catenin誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，也可以通過激活mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞的生長[13]。對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制則可以增加腎癌患者的生存期，為腎細(xì)胞癌的靶向治療提供了新的選擇[14]。

研究表明，β-catenin過表達(dá)明顯能增加腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的侵襲遷移能力，促進(jìn)腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移，當(dāng)沉默Wnt/β-catenin通路時(shí)，腎細(xì)胞癌的遷移則被明顯抑制[15]。也有研究表明，β-catenin過表達(dá)與腎細(xì)胞癌更高的分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]，這些都充分說明β-catenin在腎細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，mRCC組織中β-catenin表達(dá)高于pRCC，提示β-catenin可能在腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中具有一定的作用。不同性別、年齡mRCC患者β-catenin陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在Fuhrman 1～2級(jí)患者與3～4級(jí)患者之間的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且腎細(xì)胞癌更傾向于骨轉(zhuǎn)移。COX單因素回歸分析顯示，mRCC患者的生存期與β-catenin表達(dá)有關(guān)。提示β-catenin高表達(dá)與腎細(xì)胞癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)。

綜上所述，mRCC組織中β-catenin表達(dá)水平升高，且與Furhman分級(jí)和轉(zhuǎn)移部位相關(guān)，說明β-catenin可能通過促進(jìn)腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移導(dǎo)致不良預(yù)后，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。