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姜黃素對糖尿病腎病大鼠腎功能及腎組織JNK、Notch2/hes1信號(hào)通路的影響

2020-06-05 03:24鄧文榮石文清李海俏周志凌
山東醫(yī)藥 2020年14期
關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)姜黃腎功能

鄧文榮,石文清,李海俏,周志凌

1珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,廣東珠海519020;2珠海市人民醫(yī)院

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,若腎損傷未有效控制,可進(jìn)一步發(fā)展為終末期DN,成為糖尿病患者死亡的主要原因。DN表現(xiàn)為腎小球高濾過、腎臟肥大、白蛋白尿甚至膿毒癥[1]。DN早期干預(yù)以血壓、血糖控制和飲食干預(yù)為主,終末期DN需進(jìn)行血液透析、腹膜透析、器官移植等干預(yù);然而早期干預(yù)控制病情效果有限,透析干預(yù)局限性較大且可出現(xiàn)心腦血管意外;器官移植腎源少,可出現(xiàn)排異反應(yīng),且并不能防止DN再次發(fā)生,對合并癥狀和疾病無明顯改善效果[2]。因此,尋找有效防治DN藥物十分必要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指氧化還原狀態(tài)改變和鈣離子平衡紊亂影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞自我保護(hù)反應(yīng),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是糖尿病早期腎損傷的主要發(fā)病機(jī)制,其中涉及JNK、Notch2/hes1等多種凋亡信號(hào)通路[3]。通過干預(yù)這些信號(hào)通路來抑制腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,可能成為DN的有效干預(yù)途徑之一。姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的物質(zhì),具有抗氧化、消炎作用,用于腫瘤治療、免疫調(diào)節(jié)和抗腎纖維化等方面已獲得良好效果,且其在DN中的應(yīng)用也得到研究認(rèn)可[4,5]。2019年4~7月,我們觀察了姜黃素對DN大鼠的治療作用,以及對腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路JNK、Notch2/hes1的影響,探討姜黃素腎臟保護(hù)作用的機(jī)制,旨在為姜黃素治療DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 SPF級(jí)SD雄性大鼠70只,體質(zhì)量205~230 g,購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠自由飲水?dāng)z食,環(huán)境溫度(22±2)℃,相對濕度55%±10%,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。鏈脲佐菌素(STZ)、姜黃素均購自美國Sigma公司,PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司,BCA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。恒溫培養(yǎng)箱購自美國Forman Scientific公司,倒置顯微鏡購自日本Nikon公司,PCR擴(kuò)增儀購自美國BIORAD公司。

1.2 動(dòng)物分組與造模 將大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、姜黃素組各20只。模型組和姜黃素組腹腔注射STZ 50 mg/kg(避光溶解于pH 4.28的檸檬酸鈉緩沖液),7 d后取尾靜脈血檢測空腹血糖,收集尿液檢測尿微量白蛋白、尿肌酐,以血糖水平≥16.7 mmol/L、尿微量白蛋白和尿肌酐顯著高于正常組為造模成功。正常組常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 藥物干預(yù) 造模成功后,姜黃素組給予姜黃素混懸液(溶解于1%羧甲基纖維素鈉溶液)200 mg/(kg·d)灌胃,正常組和模型組給予等體積1%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃,連續(xù)8周。

1.4 血糖及腎功能指標(biāo)檢測 大鼠腹主動(dòng)脈采血8~10 mL,1 000 r/min離心5 min,分離血清與血漿,-20 ℃保存待測。采用羅氏血糖儀檢測血糖(GLU),日立7800型全自動(dòng)生化分析儀檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血漿白蛋白(ALB)。

1.5 腎組織病理檢查 處死大鼠,取腎組織加入4%甲醛溶液固定,常規(guī)行石蠟包埋,切成厚度為4 μm的連續(xù)切片。常規(guī)行HE及PAS染色,400倍光鏡下觀察腎組織病理變化。

1.6 腎組織JNK、Notch2、hes1 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。取大鼠腎組織,TRIzol法提取組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物由上海生物工程公司設(shè)計(jì)合成。引物序列:JNK上游5′-TGATGACGCTTACGTGGTA-3′,下游5′-GGCAAACCATTT CTCCCATA-3′;Notch2上游5′-CACCAACTTACGGATTAAACAAGCA-3′,下游5′-TCCGATTCACTGACAACAGACAC-3′;hes1上游5′-TGCTTTCCTCATCCCCAATG-3′,下游5′-GAAGGCGACACTGCGTTAGG-3′;內(nèi)參β-actin上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTG-3′,下游5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′。反應(yīng)體系:RNA 5 μg、2×ES Reaction Mix 10 μL、dT18 1 μL、RIES Mix 1 μL,并補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性0.5 min、64 ℃退火 0.5 min、72 ℃延伸45 s,共33個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,常規(guī)行瓊脂糖凝膠電泳和成像系統(tǒng)掃描,采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.7 腎組織JNK、Notch2、hes1表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取大鼠腎組織200 mg,冰上研碎,添加Ripa裂解液進(jìn)行裂解。1 000 r/min離心5 min,取上清液,采用BCA法測定總蛋白質(zhì)濃度。取5 μL上清液,加入上樣緩沖液,SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳,加入一抗,37 ℃搖床孵育2 h,4 ℃孵育過夜。加入二抗羊抗兔IgG-HRP,37 ℃搖床孵育2 h。按照Marker分割硝酸纖維素膜,暗室內(nèi)曝光。采用Image J 2X軟件分析各條帶平均光密度,以目的條帶與內(nèi)參β-actin的比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組血糖及腎功能指標(biāo)比較 與正常組比較,模型組GLU、HbA1c、Scr、BUN水平均升高而ALB水平降低(P均<0.05);與模型組比較,姜黃素組GLU、HbA1c、Scr、BUN水平下降而ALB水平升高(P均<0.05)。見表1。

表1 三組血糖及腎功能指標(biāo)比較

注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。

2.2 三組腎組織病理結(jié)果比較 正常腎組織細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整良好,細(xì)胞核清晰,血管上皮細(xì)胞為扁平或橢圓形,腎小管上皮細(xì)胞呈圓形,核大,于管腔外排列呈環(huán)形,腎小管結(jié)構(gòu)保持良好。模型組可見不同程度的腎間質(zhì)小管片狀壞死,小管上皮細(xì)胞腫脹和空泡變性,腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落,管腔變大,炎性細(xì)胞浸潤;姜黃素組也存在上述病理改變,但較模型組明顯改善。

2.3 三組腎組織JNK、Notch2、hes1 mRNA表達(dá)比較 與正常組比較,模型組JNK、Notch2、hes1 mRNA相對表達(dá)量均升高(P均<0.05);與模型組比較,姜黃素組JNK、Notch2、hes1 mRNA相對表達(dá)量降低(P均<0.05)。見表2。

表2 三組腎組織JNK、Notch2、hes1 mRNA表達(dá)比較

注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。

2.4 三組腎組織JNK、Notch2、hes1蛋白表達(dá)比較 與正常組比較,模型組JNK、Notch2、hes1蛋白表達(dá)水平均升高(P均<0.05);與模型組比較,姜黃素組JNK、Notch2、hes1蛋白表達(dá)水平均降低(P均<0.05)。見表3。

表3 三組腎組織JNK、Notch2、hes1蛋白表達(dá)比較

注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。

3 討論

糖尿病的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)生理病理過程,其中自由基引發(fā)以及介導(dǎo)的機(jī)體氧化應(yīng)激損傷、機(jī)體自由基清除能力下降,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路與糖尿病導(dǎo)致的心血管系統(tǒng)、腎臟等并發(fā)癥密切相關(guān)[6]。抑制糖尿病大鼠腎臟Notch通路相關(guān)基因表達(dá)有助于減少其蛋白尿排泄,緩解病情[7]。姜黃具有破血行氣止痛功效,用于胸痹心痛、痛經(jīng)、風(fēng)濕痛、跌撲腫痛等具有良好效果[8],姜黃提取物姜黃素具有抗氧化、抗癌、抗老年癡呆、抗炎效果[9]。在腎臟病變中,姜黃素可通過抗氧化、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)和抗腎纖維化等途徑保護(hù)腎組織、改善腎功能,且不良反應(yīng)較少,安全性較高[10]。

GLU和HbA1c是反映糖尿病病情的重要指標(biāo),長期糖代謝紊亂導(dǎo)致GLU、HbA1c水平升高,引起腎小球高血流動(dòng)力學(xué)異常和腎小球高濾過狀態(tài),入球部小血管膨脹。隨著DN的發(fā)展,開始出現(xiàn)蛋白尿和腎小球?yàn)V過率的降低,尿蛋白增多;進(jìn)展至腎功能不全失代償期后,由腎小球?yàn)V過排泄的肌酐和尿素氮升高,而血漿ALB低水平亦與腎小球?yàn)V過率降低密切相關(guān),提示肝臟的合成功能也出現(xiàn)了異常[11~13]。本研究結(jié)果顯示,模型組GLU、HbA1c、Scr、BUN水平均高于正常組,ALB水平則低于正常組,腎組織病理檢查顯示不同程度的腎間質(zhì)小管片狀壞死,小管上皮細(xì)胞腫脹和空泡變性,腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落,管腔變大,炎性細(xì)胞浸潤。表明DN大鼠發(fā)生腎小管壞死和間質(zhì)性腎炎,存在嚴(yán)重的腎功能損傷。與模型組比較,姜黃素組GLU、HbA1c、Scr、BUN水平明顯下降而ALB水平升高,腎臟組織損傷程度減輕。這表明姜黃素干預(yù)有助于控制血糖,改善腎小管濾過功能,從而減輕腎損傷。

研究顯示,抗氧化系統(tǒng)異常是影響糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[14]。氧化還原狀態(tài)改變可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的IRE-1-TRAF2-ASK1-JNK相關(guān)通路凋亡信號(hào)通路中,磷酸化的IRE-1α與TRAF2相互聚集,激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1),形成IRE1α-TRAF2-ASK1復(fù)合物,然后激活下游的c-Jun氨基末端蛋激酶(JNK),進(jìn)而參與細(xì)胞凋亡、增殖、介導(dǎo)炎性反應(yīng)等過程[15]。本研究結(jié)果顯示,模型組腎組織JNK、Notch2、hes1 mRNA及蛋白表達(dá)均較正常組升高,進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路JNK、Notch2/hes1異常可能與DN有關(guān)。與模型組比較,姜黃素組腎組織JNK、Notch2、hes1 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低,提示姜黃素可能通過干預(yù)腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路JNK、Notch2/hes1達(dá)到腎臟保護(hù)作用。

綜上所述,姜黃素能夠降低DN大鼠的血糖,改善其腎功能,具有腎臟保護(hù)作用;其機(jī)制可能是通過抑制腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路JNK、Notch2/hes1,抑制腎臟細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到腎臟保護(hù)效果。

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