李順來(lái)，姜亭起，馬天加

1濟(jì)南市第五人民醫(yī)院，濟(jì)南250022；2山東大學(xué)第二醫(yī)院

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中以膀胱尿路上皮癌所占比例最大。雖然放化療以及靶向藥物的應(yīng)用改善了早期膀胱癌患者的預(yù)后，但對(duì)于中晚期患者而言，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后仍然較差；此外，化療耐藥也是導(dǎo)致膀胱癌治療效果不理想的另一個(gè)重要原因。研究證實(shí)，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及耐藥的主要原因[1]，然而其具體機(jī)制尚未完全闡明。探討膀胱癌干細(xì)胞在膀胱癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中的機(jī)制，對(duì)于降低中晚期患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、改善預(yù)后極為重要。趨化因子受體2(CXCR2)是趨化因子受體家族中的一員，是CXC陽(yáng)性趨化因子的公共受體[2]。CXCR2在腎癌、乳腺癌以及胰腺癌等腫瘤中均出現(xiàn)差異表達(dá)，且通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、血管形成等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[3]。近年研究顯示，CXCR2在腫瘤干細(xì)胞的增殖以及侵襲、轉(zhuǎn)移中亦起著關(guān)鍵調(diào)控作用[4]。2017年10月～2019年2月，我們從膀胱癌組織中提取、培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞，采用慢病毒技術(shù)沉默干細(xì)胞中CXCR2基因的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，并分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 膀胱癌干細(xì)胞的組織來(lái)源 收集1例膀胱尿路上皮癌患者的新鮮腫瘤組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次手術(shù)經(jīng)病理證實(shí)為膀胱尿路上皮癌；②術(shù)前未接受過(guò)放化療以及內(nèi)分泌治療；③除膀胱癌以外，無(wú)其他惡性腫瘤病史；④無(wú)肝腎功能障礙以及傳染病史。本研究經(jīng)濟(jì)南市第五人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，患者簽署知情同意書。

1.2 膀胱癌干細(xì)胞的分離鑒定與CXCR2蛋白檢測(cè) 將新鮮腫瘤組織置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，去除脂肪、血管等非腫瘤組織，用眼科剪將腫瘤組織剪碎，加入1 mg/mL Ⅳ型膠原酶，37 ℃搖床上消化2 h。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，用70 μm孔徑的細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，2 000 r/min離心5 min，棄上清。加入含有表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察，2周左右開始形成懸浮細(xì)胞球，采用流式細(xì)胞儀分選CD44+膀胱癌干細(xì)胞，其余細(xì)胞標(biāo)注為CD44-細(xì)胞，接種于無(wú)血清培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。采用Western blotting法檢測(cè)CD44+與CD44-細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志基因Oct4、Sox2蛋白表達(dá)，并檢測(cè)CXCR2蛋白表達(dá)。

1.3 膀胱癌干細(xì)胞的培養(yǎng)與分組、轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種至6 cm培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞分為sh-CXCR2組和sh-scramble組，sh-CXCR2組加入慢病毒轉(zhuǎn)染試劑polybrene與CXCR2敲減慢病毒sh-scramble組加入慢病毒轉(zhuǎn)染試劑polybrene與對(duì)照scramble按照轉(zhuǎn)染說(shuō)明書操作。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 膀胱癌干細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTS法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，以2×103/孔接種于96孔板中。將細(xì)胞分為sh-CXCR2組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按照“1.3”方法進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后，每孔更換150 μL新鮮培養(yǎng)基并加入30 μL MTS工作液，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后，酶標(biāo)掃描儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 膀胱癌干細(xì)胞克隆形成能力觀察 采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)。1.2%瓊脂糖高溫高壓滅菌后放入42 ℃水浴中，加入等體積無(wú)血清培養(yǎng)基混勻，取2 mL瓊脂糖與無(wú)血清培養(yǎng)基混合液均勻鋪至6 cm培養(yǎng)皿中做為底層膠，放置4 ℃冰箱中冷卻至固態(tài)。按照“1.3”的方法對(duì)膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行分組、轉(zhuǎn)染。將2 mL高溫滅菌后的0.6%瓊脂糖與無(wú)血清培養(yǎng)基等體積混勻做為上層膠，取轉(zhuǎn)染72 h的膀胱癌干細(xì)胞以3×104/孔、100 μL培養(yǎng)基與37 ℃預(yù)熱的上層膠充分混勻，鋪至固態(tài)的底層膠上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～16 d，顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)克隆球的形成數(shù)目并拍照。

1.6 膀胱癌干細(xì)胞凋亡率測(cè)算 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，加入無(wú)EDTA的胰酶消化。PBS洗3次，按照說(shuō)明書分別加入Binding Buffer、7-ADD、Annexin Ⅴ-APC染液。槍頭吹吸混勻后避光孵育10～15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 膀胱癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力觀察 采用Transwell轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，加入無(wú)EDTA的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，聚碳酸酯微孔膜(孔徑8 μm)分布于運(yùn)動(dòng)小室和侵襲小室的上下室之間，下室加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，上室加入5×104個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱孵育6 h。顯微鏡觀察下室有明顯細(xì)胞時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，取出聚碳酸酯微孔膜，中性甲醛固定，蘇木精染色。光鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野取平均值。

1.8 膀胱癌干細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Boyden侵襲實(shí)驗(yàn)。將“1.7”中的聚碳酸酯微孔膜侵襲小室濾膜上包被人工基底膠，其余步驟同上。

1.9 膀胱癌干細(xì)胞抗凋亡相關(guān)蛋白FOXO1A、Bcl-2及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解，用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，煮沸后-20 ℃保存?zhèn)溆谩DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜，8%脫脂奶粉封閉3 h。分別加入FOXO1A、Bcl-2、MMP-2、MMP-9一抗(稀釋濃度均為1∶500)孵育過(guò)夜，加入兔二抗和鼠二抗(稀釋濃度均為1∶8 000)孵育2 h，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光底物曝光條帶，Image J軟件分析條帶光密度。以GAPDH作為內(nèi)參，以目的蛋白與GAPDH光密度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌干細(xì)胞的篩選鑒定結(jié)果及CXCR2蛋白表達(dá)情況 經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選出的CD44+膀胱癌干細(xì)胞約占全部細(xì)胞的2.37%。CD44+膀胱癌干細(xì)胞中Oct4、Sox2、CXCR2蛋白表達(dá)均高于CD44-細(xì)胞(P均<0.05)，見表1。

表1 CD44+與CD44-膀胱癌干細(xì)胞中Oct4、Sox2、CXCR2蛋白表達(dá)比較

注：與CD44-細(xì)胞比較，#P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞增殖率比較 sh-CXCR2組細(xì)胞增殖率為100%±1.54%，轉(zhuǎn)染對(duì)照組為48.41%±2.11%，sh-CXCR2組細(xì)胞增殖率低于轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 兩組克隆形成能力比較 轉(zhuǎn)染對(duì)照組克隆球形成數(shù)目為(23.47±1.97)個(gè)，sh-CXCR2組為(6.36±1.21)個(gè)，sh-CXCR2組克隆球形成數(shù)目少于轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 兩組細(xì)胞凋亡率比較 sh-CXCR2組細(xì)胞凋亡率為7.41%±0.24%，轉(zhuǎn)染對(duì)照組為0.87%±0.18%，sh-CXCR2組細(xì)胞凋亡率高于轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P<0.05)。

2.5 兩組細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力比較 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-CXCR2組穿膜細(xì)胞數(shù)為(33.17±5.48)個(gè)，轉(zhuǎn)染對(duì)照組為(249.38±9.57)個(gè)，sh-CXCR2組少于轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P<0.05)。Boyden實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-CXCR2組穿膜細(xì)胞數(shù)為(53.18±8.21)個(gè)，轉(zhuǎn)染對(duì)照組為(153.12±11.26)個(gè)，sh-CXCR2組少于轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P<0.05)。

2.6 兩組細(xì)胞FOXO1A、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 兩組細(xì)胞中FOXO1A、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較

3 討論

膀胱癌包括肌層浸潤(rùn)性膀胱癌、非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌以及轉(zhuǎn)移性膀胱癌，3類膀胱癌的治療手段和預(yù)后均相差甚遠(yuǎn)。早期非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌多采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后膀胱內(nèi)灌注化療，而對(duì)于肌層浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移性膀胱癌多采用全膀胱切除術(shù)聯(lián)合化療治療，但其復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率較高，預(yù)后極差[5]。研究顯示，膀胱癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)48%～70%，且將近半數(shù)患者術(shù)后會(huì)發(fā)生惡性進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]，給膀胱癌的治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。新近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因[7]。腫瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新和持續(xù)增殖能力，且具有多項(xiàng)分化潛能，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。腫瘤干細(xì)胞的存在是腫瘤無(wú)法根治的關(guān)鍵因素，闡明腫瘤干細(xì)胞致癌的具體機(jī)制將為腫瘤治療提供新的策略。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中存在膀胱癌干細(xì)胞[8]，但其在膀胱癌發(fā)病中的作用及機(jī)制尚不明確。

CXCR2編碼基因位于2q35，由約350個(gè)氨基酸組成，屬于G蛋白偶聯(lián)受體。其結(jié)構(gòu)域包含有胞內(nèi)端與胞外端，N末端位于胞外端，是趨化因子配體結(jié)合區(qū)；C末端位于胞內(nèi)端，是將胞外信號(hào)活化并繼續(xù)向下傳遞的關(guān)鍵區(qū)域[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，CXCR2在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Ignacio等[10]報(bào)道，CXCR2可通過(guò)調(diào)控P21抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。Cui等[11]報(bào)道，CXCR2可通過(guò)調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Huang等[12]報(bào)道，CXCR2可增強(qiáng)腎癌細(xì)胞的干樣特性。Wang等[13]認(rèn)為，CXCR2可能是一個(gè)新的干細(xì)胞標(biāo)記物，CXCR2可通過(guò)CXCR2-Src-PKL/Vav2-Rac1促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞遷移[14]，推測(cè)CXCR2可能通過(guò)調(diào)控膀胱癌干細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移而促進(jìn)膀胱癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。本研究采用原代培養(yǎng)技術(shù)分離CD44+膀胱癌干細(xì)胞，采用Western blotting法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CXCR2在膀胱癌干細(xì)胞中呈高表達(dá)。為了進(jìn)一步研究CXCR2在膀胱癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中的作用，我們將慢病毒轉(zhuǎn)染試劑polybrene與CXCR2敲減慢病毒轉(zhuǎn)染至膀胱癌干細(xì)胞中，觀察沉默CXCR2基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果顯示，sh-CXCR2組細(xì)胞增殖能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯減弱。表明CXCR2可以促進(jìn)膀胱癌干細(xì)胞增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移。

最新研究發(fā)現(xiàn)，CXCR2可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如CDK4、CDK6促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡[15]。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，Bcl-2凋亡信號(hào)通路是線粒體途徑引發(fā)的細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。細(xì)胞凋亡信號(hào)經(jīng)胞質(zhì)傳遞至線粒體，并通過(guò)BH結(jié)構(gòu)域與線粒體膜上的Bcl-2蛋白結(jié)合，降低Bcl-2的抗凋亡作用[16]。FOXO1A是叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOX家族的重要一員，參與調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激、DNA損傷以及細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。FOXO1A是Bcl-2上游的調(diào)節(jié)因子，CXCR2可能是通過(guò)FOXO1A/Bcl-2通路，調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，沉默CXCR2基因表達(dá)后，sh-CXCR2組FOXO1A、Bcl-2蛋白表達(dá)均降低。提示CXCR2可通過(guò)調(diào)控FOXO1A通路抑制膀胱癌干細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖。

MMP-2和MMP-9屬于MMP家族成員，其主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)。與其他MMP相比，MMP-2催化區(qū)含有半胱氨酸嵌入物，在與膠原蛋白以及彈力蛋白結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MMP-9位于20q11.1～13.1上，其含有一個(gè)O-糖基化的膠原蛋白V樣嵌入物，促進(jìn)MMP-9與血紅素樣區(qū)結(jié)合。目前研究已經(jīng)證實(shí)，MMP-2以及MMP-9在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管形成以及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程中均起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，沉默CXCR2基因表達(dá)后，sh-CXCR2組MMP-2、MMP-9表達(dá)均降低。提示CXCR2可通過(guò)調(diào)控MMP-2、MMP-9的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。

綜上所述，CXCR2在膀胱癌干細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默其表達(dá)可以降低膀胱癌干細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)作用于凋亡相關(guān)蛋白FOXO1A、Bcl-2，調(diào)控凋亡通路進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，通過(guò)調(diào)控侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。該研究為治療膀胱癌提供了新的策略，CXCR2可能成為膀胱癌治療的潛在靶點(diǎn)。