朱延杰，尤平洪，唐良友，段曉波，張姚，代慶德，呂東

1德陽市人民醫(yī)院，四川德陽618000；2四川省人民醫(yī)院(東院)

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一。2018年的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，世界范圍內(nèi)有超過130萬例新發(fā)前列腺癌病例和35.9萬例相關(guān)死亡病例[1]。盡管在治療效率方面取得了巨大進(jìn)展，但前列腺癌患者的長(zhǎng)期生存情況仍然不佳[2]。分子靶向治療是腫瘤治療的新型手段，在分子水平研究前列腺癌的發(fā)病機(jī)制有助于尋找對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)，提高前列腺癌的治療效果。已有研究證實(shí)，微小RNA(miRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。miR-142-5p對(duì)人體免疫調(diào)節(jié)具有重要作用，在乳腺癌、骨肉瘤和胰腺癌等惡性腫瘤中miR-142-5p呈異常表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[4～6]。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(TOP2A)在多種腫瘤中報(bào)道為癌基因，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[7，8]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路與包括前列腺癌等腫瘤的惡進(jìn)展密切相關(guān)，可作為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)[9]。本研究通過驗(yàn)證miR-142-5p與TOP2A的靶向關(guān)系，并觀察miR-142-5p過表達(dá)對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，分析其潛在的作用機(jī)制，旨在獲得miR-142-5p作為治療前列腺癌候選靶點(diǎn)的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選擇2017年1月～2018年6月在德陽市人民醫(yī)院行手術(shù)切除的前列腺癌患者40例，年齡47～81(58.96±18.42)歲。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過，由患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 前列腺癌組織中miR-142-5p、TOP2A mRNA表達(dá)檢測(cè) 收集手術(shù)切除的前列腺癌組織，加入TRIzol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以其為擴(kuò)增模板，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒，采用7500 qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)計(jì)合成miR-142-5p引物上游5′-GGCCCATAAAGTAGAAAGC-3′，下游5′-TTTGGCACTAGCACATT-3′。U6引物上游5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCA-3′,下游5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。TOP2A引物上游5′-ACCATTGCAGCCTGTAAATGA-3′,下游5′-GGGCGGAGCAAAATATGTTCC-3′。GAPDH引物上游5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,下游5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s、70 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)各樣品的循環(huán)閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-142-5p相對(duì)表達(dá)量，GAPDH為內(nèi)參計(jì)算TOP2A mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 miR-142-5p靶向調(diào)控TOP2A的驗(yàn)證 前列腺癌LNCaP細(xì)胞復(fù)蘇后，重懸至含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-142-5p的靶基因。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LNCaP細(xì)胞，以4×103/孔接種到96孔板中，分為NC wt、miR-142-5p wt和NC mut、miR-142-5p mut組。接種24 h后采用lipofectamine2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，NC wt組轉(zhuǎn)染TOP2A-wt和NC，miR-142-5p wt轉(zhuǎn)染TOP2A-wt和miR-142-5p mimic，NC mut轉(zhuǎn)染TOP2A-mut和NC，miR-142-5p mut組轉(zhuǎn)染TOP2A-mut+miR-142-5p mimic，6 h后換液。收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LNCaP細(xì)胞，按2×105/孔接種至6孔板中，分為正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和TOP2A過表達(dá)組。接種24 h后采用lipofectamine2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，正常對(duì)照組轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR-142-5p mimic、TOP2A過表達(dá)組轉(zhuǎn)染miR-142-5p mimic和TOP2A過表達(dá)質(zhì)粒，6 h換液。轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗3次，胰酶消化收集細(xì)胞斑塊，加入TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，采用qPCR方法檢測(cè)正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和TOP2A過表達(dá)組TOP2A表達(dá)，評(píng)價(jià)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需要求。

1.5 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTS實(shí)驗(yàn)。取三組細(xì)胞，按2×103/孔接種至96孔板中，分為正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和TOP2A過表達(dá)組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。接種24 h后采用lipofectamine2000進(jìn)行各組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，6 h換液。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)棄掉培養(yǎng)基，加入100 μL培養(yǎng)基和20 μL MTS，設(shè)置空白對(duì)照孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。采用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)OD值/(對(duì)照孔-空白孔)OD值×100%。

1.6 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Boyden實(shí)驗(yàn)。取三組細(xì)胞，PBS沖洗，加入無血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105/mL。取100 μL細(xì)胞懸液加到侵襲小室上室的Boyden基質(zhì)膠上，下室加入500 μL含10% FBS培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h后，PBS洗去上室未穿膜的細(xì)胞，下室穿膜的細(xì)胞經(jīng)甲醇固定15 min、結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗后干燥，在顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取三組細(xì)胞，加入裂解液提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。加入上樣緩沖液煮沸變性，SDS-PAGE凝膠上樣后80 V電泳2 h分離目的蛋白，350 mA濕轉(zhuǎn)2 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% BSA室溫孵育1 h，封閉PVDF膜上非特異性蛋白，加入Wnt3a、β-catenin一抗(稀釋比例均為1∶500)和內(nèi)參一抗(稀釋比例為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。洗膜，加入兔二抗(稀釋比例為1∶8 000)室溫孵育3 h，洗膜。用ECL試劑盒曝光蛋白條帶。用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH為參照，計(jì)算Wnt3a、β-catenin目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織中miR-142-5p、TOP2A mRNA表達(dá)比較 前列腺癌組織中miR-142-5p表達(dá)水平為0.72±0.38，癌旁組織為1.00±0.36，前列腺癌組織中miR-142-5p表達(dá)下調(diào)(t=6.15,P=0.000)。前列腺癌組織中TOP2A mRNA表達(dá)水平為1.62±0.58，癌旁組織為1.00±0.31，前列腺癌組織中TOP2A mRNA表達(dá)上調(diào)(t=3.73,P=0.000)。Pearson相關(guān)分析顯示，前列腺癌組織中miR-142-5p與TOP2A mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.601，P=0.024)。

2.2 miR-142-5p對(duì)TOP2A mRNA的靶向調(diào)控作用 TargetScan7.1軟件在線預(yù)測(cè)顯示，TOP2A基因啟動(dòng)子區(qū)與miR-142-5p具有結(jié)合位點(diǎn)，見表1。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC wt組相比，miR-142-5p wt組熒光素酶活性降低(P<0.05)；而NC mut組與miR-142-5p mut組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 TOP2A mRNA與miR-142-5p結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

表2 各組細(xì)胞中熒光素酶活性比較

注：與NC wt組比較，*P<0.05。

2.3 三組細(xì)胞增殖能力比較 正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和TOP2A過表達(dá)組的細(xì)胞增殖率分別為100%±1.00%、37.35%±6.35%、54.68%±3.06%。與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染對(duì)照組和TOP2A過表達(dá)組細(xì)胞增殖率降低；與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，TOP2A過表達(dá)組細(xì)胞增殖率升高(P均<0.05)。2.4 三組細(xì)胞侵襲能力比較 正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和TOP2A過表達(dá)組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(78.39±11.65)、(30.12±5.28)、(55.07±8.34)個(gè)。與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染對(duì)照組和TOP2A過表達(dá)組的細(xì)胞穿膜數(shù)減少；與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，TOP2A過表達(dá)組細(xì)胞穿膜數(shù)增加(P均<0.05)。

2.5 三組細(xì)胞Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)比較 與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染對(duì)照組和TOP2A過表達(dá)組Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)降低；與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，TOP2A過表達(dá)組Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)增加(P均<0.05)。見表3。

表3 三組Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)比較

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，#P<0.05。

3 討論

目前前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)療法是手術(shù)和放療，但手術(shù)或放療者仍有約8.4%的復(fù)發(fā)率[10]。由于前列腺癌癥狀具有隱匿性，患者確診時(shí)多為晚期，雄激素剝奪治療雖然可減輕70%～80%患者的癥狀，但大多數(shù)患者將在2年內(nèi)復(fù)發(fā)至無法治愈的雄激素非依賴狀態(tài)[11]。此外，晚期患者最常發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。因此研究前列腺癌治療的藥物靶點(diǎn)至關(guān)重要。

前列腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及癌基因和抑癌基因的失控及表觀遺傳學(xué)的改變。miRNA是內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度為19～22個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA參與了干細(xì)胞發(fā)育、自噬、轉(zhuǎn)化、增殖控制、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞生理過程[12]，同時(shí)miRNA的異常表達(dá)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，使其成為腫瘤預(yù)后、診斷潛在標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[3]。miR-142是少數(shù)造血系統(tǒng)特異性miRNA之一，以miR-142-3p和miR-142-5p兩種成熟同工型形式存在，miR-142-5p主要表達(dá)在胸腺來源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中[13]。miR-142-5p在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，miR-142-5p在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)增加，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的作用[4]。而miR-142-5p在骨肉瘤和胰腺癌中低表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[5，6]。這表明miR-142-5p依據(jù)不同的腫瘤類型，既可以發(fā)揮致癌又可以發(fā)揮抑癌作用。miRNA通過與靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)部分互補(bǔ)結(jié)合來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的沉默，研究報(bào)道m(xù)iR-142-5p確定的調(diào)控靶基因包括PTEN、PLA2G16和RAP1A等[4～6]。本研究采用生物學(xué)信息預(yù)測(cè)軟件和雙熒光素酶報(bào)道基因試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TOP2A基因啟動(dòng)子區(qū)與miR-142-5p有結(jié)合位點(diǎn)，是miR-142-5p的靶基因。

TOP2A是一種必需的核酶，在轉(zhuǎn)錄過程中調(diào)節(jié)DNA的拓?fù)錉顟B(tài)，并參與染色體濃縮和染色單體分離[14]。研究報(bào)道，TOP2A高表達(dá)預(yù)示著各種人類癌癥的不良預(yù)后[7，8]。我們推測(cè)，miR-142-5p和TOP2A在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌組織中miR-142-5p低表達(dá)，TOP2A mRNA高表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)；過表達(dá)miR-142-5p能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。這表明miR-142-5p在前列腺癌中發(fā)揮抑癌作用，與其在骨肉瘤[5]和胰腺癌[6]中的作用相同。進(jìn)一步研究顯示，增加的TOP2A可顯著減弱miR-142-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用，表明miR-142-5p通過靶向TOP2A抑制前列腺癌的惡性進(jìn)展。

此外，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤增殖和侵襲密切相關(guān)，在前列腺癌中處于激活狀態(tài);Wnt3a和β-catenin是該通路的關(guān)鍵蛋白，在前列腺癌中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[9]。本研究結(jié)果顯示，miR-142-5p能夠抑制前列腺癌細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)，而TOP2A能夠減弱miR-142-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin蛋白的抑制作用。表明miR-142-5p靶向TOP2A抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述，前列腺癌組織中miR-142-5p表達(dá)降低，TOP2A表達(dá)降低增加，二者呈負(fù)相關(guān)；miR-142-5p靶向調(diào)控TOP2A基因抑制前列腺癌的進(jìn)展，可能通過使Wnt/β-catenin信號(hào)通路失活。