結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在全球其發(fā)病率及死亡率均位居第3位[1]。近幾十年中，中國結(jié)直腸癌的治療已經(jīng)取得了實質(zhì)性進展，但是結(jié)直腸癌相關的死亡率并未顯著改善[2-4]。因此，探索具有診斷價值的腫瘤標記物對于結(jié)直腸癌患者的早期診斷和預后至關重要。

驅(qū)動蛋白家族（KIFs）是一類微管依賴的運動蛋白，主要負責微管穩(wěn)定、解聚、細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和細胞分裂[5]。自1985年首次證實以來，驅(qū)動蛋白家族成員陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，包括14個超家族（超過40個成員）[6]。越來越多的證據(jù)表明，驅(qū)動蛋白在多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7-8]。KIF23是驅(qū)動蛋白家族中的一員，其在細胞運動過程中骨架的改變和細胞分裂過程中紡錘體的形成均有重要作用[9-10]。KIF23在多種癌癥中過表達，但目前尚缺乏KIF23在結(jié)直腸癌中的研究報道。

本研究通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中KIF23在結(jié)直腸癌組織中的表達，應用免疫組織化學法對116例結(jié)直腸癌患者中KIF23的表達進行檢測，探討其表達與臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2010年2月至2013年2月期間于河南大學淮河醫(yī)院行手術治療的116例結(jié)直腸癌患者組織標本及臨床病理資料。納入標準：1）有完整臨床資料；2）術后病理確診為結(jié)直腸癌患者；3）術前未行放療、化療及內(nèi)分泌等治療；4）已簽署知情同意書。排除標準：1）復發(fā)性結(jié)直腸癌患者；2）合并其他腫瘤病史。其中男性67例，女性49例。腫瘤分化程度：高分化3例，中分化86例，低分化27例。腫瘤位置：升結(jié)腸26例，橫結(jié)腸7例，降結(jié)腸4例，乙狀結(jié)腸23例，直腸56例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）第8版確定腫瘤TNM分期。

1.2 方法

1.2.1 隨訪 通過門診或住院就診、電話、微信等方式隨訪，確診時間為起點，所有患者進行5年隨訪，期間若有腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡則終止隨訪。

1.2.2 生物學分析 本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）下載所有可用的結(jié)直腸癌KIF23 mRNA數(shù)據(jù)表達譜，包括380例癌組織和51例癌旁正常組織，使用Excel 2019和GraphPad 6.0 軟件對數(shù)據(jù)進行Log2轉(zhuǎn)換和分析。

1.2.3 免疫組織化學法檢測 結(jié)直腸癌組織中KIF23 蛋白表達的檢測嚴格按照SP 免疫組織化學試劑盒說明書進行操作。將石蠟包埋的組織標本行連續(xù)切片，厚度約4 μm，切片行二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水。切片置于檸檬酸抗原修復緩沖液的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復，中火8 min至沸，?；? min 保溫再轉(zhuǎn)中低火7 min，3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min，血清封閉30 min 后，加入KIF23 抗體（克隆號：Q02241，1：100，美國Cusabio 公司）4℃過夜。第2天PBS 沖洗3次后加入相應種屬二抗，室溫孵育50 min，DAB顯色劑顯色，蘇木素復染，返藍，脫水，透明，中性樹脂封片。

1.2.4 結(jié)果判定 病理結(jié)果由本院兩名資深病理科主任醫(yī)師分別閱片完成。切片中出現(xiàn)黃色或褐色顆粒狀物質(zhì)為陽性，染色強度標準評分：0分，不著色；1分，淡黃色（弱陽性）；2分，棕黃色（中陽性）；3分，棕褐色（強陽性）。腫瘤細胞比例：0分：無陽性結(jié)果；1分：＜25%的陽性結(jié)果；2分：25%～50%的陽性結(jié)果；3分：50%～75%的陽性結(jié)果；4分：≥75%的陽性結(jié)果。將陽性結(jié)果的百分比和染色強度的得分相乘即為最終染色指數(shù)（SI）：0～1分為陰性表達，2～3分為低表達，≥4分為高表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用χ2檢驗分析KIF23表達與患者病理參數(shù)及預后相關性；生存曲線采用Kaplan-Meier 法繪制，Log-Rank 檢驗進行單因素分析，Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中KIF23 mRNA表達水平

在TCGA數(shù)據(jù)庫中，對結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中KIF23的mRNA表達水平進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，在配對組織（P＜0.001，圖1A）及非配對組織（P＜0.001，圖1B）中，KIF23在結(jié)直腸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織。

2.2 KIF23在結(jié)直腸癌組織中的蛋白表達水平

采用免疫組織化學法分析KIF23在結(jié)直腸癌組織中的蛋白表達水平。KIF23 蛋白的表達主要定位于細胞質(zhì)（圖2），結(jié)直腸癌組織中KIF23 陽性表達呈棕色或棕褐色。結(jié)果顯示，KIF23在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達率為61.2%（71/116），陰性或低表達率為38.8%（45/116）。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中KIF23在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中表達差異

2.3 結(jié)直腸癌中KIF23的表達與臨床病理特征的關系

如表1所示，結(jié)直腸癌中KIF23的表達與T、N、M及TNM分期密切相關（P＜0.05），與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度和腫瘤位置無相關性（P＞0.05）。

2.4 KIF23表達水平與結(jié)直腸癌患者預后的相關性

Kaplan-Meier 生存分析表明，KIF23 高表達的結(jié)直腸癌患者的總生存期和無復發(fā)生存期相比低表達患者明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖3）。Cox回歸分析結(jié)果顯示KIF23表達可作為影響結(jié)直腸癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05，表2，3）。

圖2 KIF23在結(jié)直腸癌組織中蛋白的表達情況

表1 KIF23表達與116例結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關系

表1 KIF23表達與116例結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關系（續(xù)表1）

圖3 Kaplan-Meier分析KIF23表達對患者預后的影響

表2 單因素及Cox多因素分析各因素對結(jié)直腸癌患者總生存期的影響

表3 單因素及Cox多因素分析各因素對結(jié)直腸癌患者無復發(fā)生存期的影響

表3 單因素及Cox多因素分析各因素對結(jié)直腸癌患者無復發(fā)生存期的影響（續(xù)表3）

3 討論

作為驅(qū)動蛋白家族的一員，KIF23 發(fā)揮“分子馬達”的作用[11]。KIF23 通過參與微管的聚合動力學，在細胞周期內(nèi)催化MT細胞骨架的快速空間重塑，是細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和有絲分裂的關鍵調(diào)節(jié)劑[12-13]。在有絲分裂過程中，KIF23 參與了中間體的形成，并通過招募參與細胞分裂的調(diào)節(jié)因子進一步影響胞質(zhì)分裂過程[14]。KIF23的過度表達可能會導致一系列問題，其中包括紡錘體的分離增加、過早的姐妹染色單體分離，以及最終單極或雙極紡錘體的形成[15]。有絲分裂過程中姐妹染色體分離發(fā)生異常，導致染色體非整倍性和基因組的不穩(wěn)定，最終可能誘發(fā)腫瘤[16]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，KIF23在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，且與腫瘤轉(zhuǎn)移和不良預后相關，參與腫瘤的惡性進展過程。KIF23過表達與ER陽性乳腺癌患者預后顯著相關，敲除KIF23可抑制他莫昔芬敏感和耐藥乳腺癌細胞的增殖并誘導凋亡[17]。有研究顯示，KIF23在肝細胞肝癌中表達上調(diào)，且與患者不良預后相關[18]。在非小細胞肺癌中KIF23 高表達，沉默KIF23表達可抑制腫瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡，從而改善患者預后[19]。本研究證實KIF23在結(jié)直腸癌組織中高表達，并且高表達KIF23 患者預后較差，與上述結(jié)論一致。通過分析KIF23表達與臨床病理特征的相關性，得出KIF23表達水平與T、N、M及TNM分期密切相關，提示其與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關。進一步通過Cox回歸分析說明KIF23表達是影響結(jié)直腸癌患者總生存期及無復發(fā)生存期的獨立危險因素。提示KIF23可能作為預測結(jié)直腸癌患者發(fā)生發(fā)展及預后的分子標記物。

既往研究表明，KIF23與影響腫瘤細胞分裂、染色體分離、增殖和轉(zhuǎn)移的多種癌基因的表達相關[18]。有研究發(fā)現(xiàn)沉默KIF23在體內(nèi)和體外均抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖，并且在轉(zhuǎn)錄水平上受TCF-4調(diào)控[20]。TCF-4是經(jīng)典Wnt/β-catenin/TCF 通路的核心組成部分[21]，其與細胞核中的β-catenin相互作用形成復合物，從而調(diào)節(jié)多個基因的轉(zhuǎn)錄，影響細胞的增殖、分化、存活和凋亡。有研究表明，通過shRNA沉默KIF23調(diào)控細胞有絲分裂過程可抑制腫瘤細胞的增殖，從而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展[22]。Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞中過表達的KIF23可促進腫瘤細胞增殖和遷移以及細胞周期進展。但是KIF23在腫瘤中作用的分子機制尚未明確，有待進一步研究。

綜上所述，KIF23高表達預示結(jié)直腸癌患者的不良預后，并參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。因此，監(jiān)測KIF23表達可能為結(jié)直腸癌的臨床診療及預后評估提供重要的參考價值。