李彩藝 謝文靜 王福生

大理大學藥學與化學學院，大理 671000

多糖是由10個及以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的糖，屬于高分子化合物。研究表明許多植物多糖具有免疫調節(jié)、降血脂、降血糖、抗腫瘤等生物活性[1]。雙參(Triplostegiaglandulifera)為川續(xù)斷科雙參屬植物，又稱蘿卜參、對對參、童子參、肚拉、土洋參和一支蒿等，主要產(chǎn)于云南、西藏、四川等地[2-3]，課題組前期對雙參小分子化合物進行了系列研究，尚未見文獻報道雙參多糖的研究。本課題旨在研究雙參不同分子量雙參多糖的抗氧化活性，以期為進一步研究雙參多糖結構與活性提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HPLC-1260型高效液相色譜儀；FY135型中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；湘立離心機TD5A-WS(湖南湘立科學儀器有限公司)；Shodex OHpak 804色譜柱(300 mm×7.5 mm)。

1.2 材料 右旋糖苷系列標準品180 Da(批號：140637-201203)、2500 Da(批號：140638-201203)、4600 Da(批號：140639-201203)、7100 Da(批號：140640-201203)、10000 Da(批號：140641-201203)、21400 Da(批號：140642-201203)、41100 Da(批號：140643-201203)、84400 Da(批號：140644-201203)、133800 Da(批號：140645-201203)、2000 kDa(批號：140646-201203)均購自中國食品藥品檢定研究院；1 mol/L Tis-Hcl緩沖液(批號：20190219，北京索萊寶公司)、DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼自由基，批號：ZZZQK-EE，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司),水楊酸、H2O2、鄰苯三酚、VC均購自國藥集團化學試劑有限公司。

雙參植物于2017年10月采自于云南省大理州云龍縣五寶山，經(jīng)大理大學段寶忠教授鑒定為川續(xù)斷科雙參屬植物雙參(TriplostegiaglanduliferaWall.)的地下根，植物樣本(編號:WFS-20171017)存放于大理大學藥學與化學學院王福生教授課題組。

2 方法

2.1 提取與分離 取雙參塊根進行干燥(50 ℃恒溫干燥)，利用粉碎機粉碎雙參塊根至80目篩制成干粉備用。稱取干燥的雙參粉末1 Kg，加入95%乙醇2 L冷浸過夜，棄上清，濾出藥渣，加入2 L蒸餾水置于索式提取器中加熱回流，每次2 h，此操作重復三次，合并續(xù)濾液，經(jīng)減壓濃縮后利用Sevag法去除蛋白，萃取后上層為蛋白質層，棄去，濃縮下層濾液成浸膏200 g溶解至蒸餾水中通過AB-8大孔吸附樹脂柱層析脫去色素等小分子雜質，依次采用蒸餾水、30%甲醇-水和60%甲醇-水洗脫劑洗脫。以苯酚硫酸法監(jiān)測合并具有同一峰型的洗脫成分即得雙參粗多糖，將雙參粗多糖減壓濃縮至600 mL。采用分步醇沉的方法，依次加入無水乙醇至醇沉濃度分別為 40%，60%和80%，置4 ℃冰箱內過夜。3500 rpm離心10 min，沉淀冷凍干燥分別得不同分子量的雙參多糖TGPA、TGPB和TGPC。

2.2 不同分子量雙參多糖相對分子質量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Shodex OHpak 804(300 mm×7.5 mm)；流動相：超純水；濃度：標準品及樣品質量濃度均為1 mg/mL；進樣量：10 μL；體積流量：0.5 mL/min；柱箱溫度：35℃；氮氣流速：1.3 mL/min，蒸發(fā)光檢測器蒸發(fā)溫度：55℃；霧化溫度：45℃。

2.2.2 含量測定 將右旋糖酐標準品180、2500、4600、7100、10000、21400、41100、84400、133800 Da、2000 KDa依次進樣，測定保留時間。以相對分子質量對數(shù)(log Mw)為縱坐標保留時間(tR)為橫坐標繪制標準曲線。根據(jù)線性回歸方程計算樣品的Mw。

2.3 清除DPPH活性作用的測定 精密稱取DPPH粉末0.0128 g于50 mL容量瓶加入無水甲醇定容至刻度線，配制成0.65 mmol/L的DPPH-甲醇溶液，將多糖溶液配制成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液，向96孔板中加入50 μL不同濃度的樣品溶液，每個樣品濃度設5個復孔，再向各孔中加入150 μL DPPH甲醇溶液，以相同濃度的Vc溶液作陽性對照組，蒸餾水作空白對照，于室溫黑暗處放置30 min后，酶標儀517 nm波長處測定吸光度值。根據(jù)公式1計算TGPA、TGPB和TGPC的清除率。

公式1=(Ablank-Asample)/Ablank

2.4 清除超氧陰離子作用測定 按照 Kao 等方法[4]，將多糖溶液配制成濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液。取10 mL試管加入1 mL多糖溶液，依次向試管中加入0.05 mol/L Tis-HCl(pH=8.2)4.5 mL，25 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，于25℃水浴反應5 min后，加入8 mmol/L HCl 1 mL終止反應，以相同濃度的Vc作陽性對照組，蒸餾水作空白對照組。于299 nm處測定吸光度值，根據(jù)公式2計算不同醇沉濃度多糖對超氧陰離子的清除率。

公式2=(Ablank-Asample)/Ablank

3 結果

3.1 相對分子量的測定 根據(jù)系列不同分子量系列的標準品，按照相對分子質量對數(shù)(log Mw)為縱坐標；保留時間(tR)為橫坐標繪制標準曲線，得曲線方程式為：y=-0.3491x+9.9531，R2=0.994。根據(jù)高效凝膠出峰時間(圖2所示)可知TGPA分子量范圍為1600～2000 KDa ；TGPB分子量范圍為630～2000 KDa ；TPGC分子量范圍為230～2000 KDa。其中TGPA主要的分子量為2000 KDa、TGPB主要為 691830KDa、 TGPC主要為575439KDa。如圖1所示。

3.2 抗氧化活性 由圖2可知，TGP-(A-C) 對DPPH和超氧陰離子的清除作用結果顯示：在不同濃度下TGPA、TGPB和TGPC均對DPPH自由基和超氧陰離子均有一定的清除作用，其清除能力呈濃度依賴性。不同分子量的雙參多糖對DPPH的清除作用效果沒有太大的差距。而對于超氧陰離子的清除作用中，TGPC清除超氧陰離子的效果最為顯著。TGPA和TGPB對超氧陰離子的清除也有一定的效果，其中TGPA的清除效果最弱。

4 結論

近年來，隨著多糖研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)植物多糖具有很多良好的生物活性。例如抗腫瘤、抗疲勞、降血糖等生物活性。而對雙參多糖的研究尚未見其報道。本實驗將雙參多糖經(jīng)水提醇沉、Sevag法脫蛋白、AB-8大孔吸附樹脂柱分離，分步醇沉得到不同分子量的雙參多糖。以蒸餾水作流動相，蒸發(fā)光檢測器檢測，采用不同分子量標準品建立標準曲線，從而確定雙參多糖的分子量。理論上，分步醇沉中，低體積分數(shù)的乙醇溶液沉淀下來的雙參多糖相對分子質量越大，而上清液部分則是相對分子質量小的雙參多糖或寡糖，隨著醇沉的次數(shù)增多，沉淀體積越來越少，離心后依舊存在少量沉淀部分存在上清液中，導致分子量存在交叉。由于交叉存在量很少可忽略不計。綜合藥理活性結果表明：不同分子量段的雙參多糖均對DPPH體系和超氧陰離子體系具有清除作用，TGPA、TGPB和TGPC對DPPH的清除作用遠遠低于Vc的清除作用，而對超氧陰離子的清除作用中可以看出TGPC的清除作用遠大于TGPA和TGPB雙參多糖，當濃度達到1 mg/mL時清除超氧陰離子的作用與抗壞血酸作用相當。從而可以進一步推測在TGPC雙參多糖具有更好的清除作用，繼而為雙參均一多糖的分離純化、結構表征、藥理活性及其作用機制的進一步研究提供了基礎材料。