孫 青，秦雪梅，曹德林，李菊紅，高 萍

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院耳鼻喉科（上海201700）；

2.上海市青浦區(qū)朱家角人民醫(yī)院耳鼻喉科（上海201700）

老年性耳聾臨床常見，其形成與聽覺(jué)系統(tǒng)的衰老、遺傳、高血壓、高血糖、高脂血癥及耳毒性藥物等有關(guān)［1］。免疫、炎癥介導(dǎo)因素對(duì)促進(jìn)病變的形成有一定價(jià)值。白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-17（IL-17）均為促進(jìn)病變形成的重要因子。有研究顯示兩者高表達(dá)與老年性耳聾有關(guān)［2］。促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）是一類能夠促進(jìn)機(jī)體造血功能的激素類糖蛋白分子，具有促進(jìn)造血活性的生物學(xué)功能。EPO可能對(duì)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌具有顯著抑制效果［3］。近年研究顯示EPO 對(duì)缺血和慶大霉素造成的毛細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［4］?；诖宋覀兘⒗夏晷远@的小鼠模型，應(yīng)用EPO 進(jìn)行干預(yù)，并進(jìn)行對(duì)照觀察，探討其對(duì)血清和耳蝸中IL-6和IL-17的調(diào)節(jié)作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，選擇5周齡小鼠48只，體重（20.3±5.6）g，無(wú)噪聲暴露史和耳毒性藥物應(yīng)用史，無(wú)中耳炎病史。其中36只用于建立老年性耳聾的模型。

2 造模方法 36只小鼠采用腹腔注射的方法，依據(jù)每只小鼠的體重注射濃度為150 mg／（kg·d）的D-半乳糖溶液，共60 d，完成老年性耳聾小鼠模型的建立。

3 干預(yù)方法 將模型小鼠分為EPO 干預(yù)組（EPO 組）、生理鹽水干預(yù)組（NS組）和對(duì)照組（C 組），均為12只。EPO 組應(yīng)用EPO 進(jìn)行干預(yù)，以1000 U／kg的濃度，腹腔注射，2次／周，共8周。NS組以等量生理鹽水腹腔注射，2次／周，共8周。C 組不進(jìn)行任何處理。

4 靜脈血的留取 治療結(jié)束后第2天，應(yīng)用腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，用剪刀沿腹中線剪開腹部，完全暴露腹腔，將腸道、胃等器官撥開，分離腹部血管，找到下腔靜脈（位于腹部較粗的藍(lán)色血管）。將頭皮針下端與5 ml注射器相連，用頭皮針刺入下腔靜脈靠近下端處，抽吸注射器，取2 ml靜脈血，離心后分離血清，置于-80℃冰箱中凍存，備用。

5 耳蝸取材 取血后，用剪刀沿小鼠頸部剪斷皮膚、肌肉和頸椎。從枕骨大孔沿頭正中線依次剪開頭皮層和顱骨，暴露腦組織并去除。沿著正中線將顱底剪開，用眼科剪剪斷兩側(cè)顳巖部，找到聽泡，分離出耳蝸。剪去耳蝸周圍骨質(zhì)，于鹽水中沖洗血漬，置于-80℃冰箱中凍存，備用。

6 檢測(cè)方法

6.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)耳蝸組織中IL-6和IL-17的表達(dá):基于術(shù)后石蠟包埋組織，切取4μm 切片后嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟操作。IL-6和IL-17的一抗為濃縮液，購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司，二抗和DAB購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。按不同比例稀釋后行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇IL-6（1∶50）和IL-17（1∶100）的配比濃度（顯色效果最佳）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)均由同一檢驗(yàn)師完成，減少人為誤差，做好質(zhì)控。結(jié)果評(píng)判:IL-6和IL-17的陽(yáng)性部位為細(xì)胞質(zhì)，隨機(jī)觀察3個(gè)顯色明顯的上皮細(xì)胞分布區(qū)（400倍視野），分別進(jìn)行陽(yáng)性率和著色強(qiáng)度的計(jì)分。陽(yáng)性率:≤25%為1 分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色強(qiáng)度:無(wú)著色為0分，淡黃為1分，棕黃為2分，黃褐為3分。兩者相加為最后得分，分值為0～7分。以≤2分為陰性，＞2分為陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性率。

6.2 ELISA 法檢測(cè)血清中IL-6 和IL-17 的表達(dá):嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟操作，均由同一檢驗(yàn)師操作，做好實(shí)驗(yàn)質(zhì)控工作。

6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)耳蝸組織中IL-6和IL-17 m RNA 的表達(dá):基于術(shù)后新鮮凍存組織，首先提取總RNA。IL-6 引物上游:5'-AAACTGCGTACATGCGCTG-3'，下 游:5'-TACTGTGGCACCGCATCGTT-3'。IL-17 引物上游:5'-CTGCCGTGGGAACCCTAAACGCTG-3'， 下 游:5'-CTGACGTGTGTGGCACTCTT-3'。選擇U6 作為內(nèi)參，引物上游:5'-GGAACCAGAAAGATTAGC-3'，下游:5'-TTGGAACGCACGAATTCCG-3'。引物由蘇州睿贏生物技術(shù)有限公司合成。相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)ABI公司。嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系:95℃5 min，循環(huán)1次；95℃、25 s，64℃、20 s，72℃、20 s，循環(huán)15次；93℃、25s，60℃、35 s，72℃、20 s，循環(huán)35次。于60℃收集信號(hào)。讀取CT 值，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)水平。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，行卡方檢驗(yàn)和方差分析（SNK 法行兩兩比較），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組耳蝸組織中IL-6和IL-17表達(dá)陽(yáng)性率比較 免疫組化結(jié)果顯示:C 組和NS 組IL-6 和IL-17的陽(yáng)性率明顯高于CK 組，EPO 組IL-6和IL-17的陽(yáng)性率明顯低于C組和NS組，見表1。

表1 各組耳蝸組織中IL-6和IL-17表達(dá)陽(yáng)性率比較［只（%）］

2 各組血清中IL-6和IL-17表達(dá)比較 ELISA結(jié)果顯示:C組和NS組血清中IL-6和IL-17的表達(dá)量明顯高于CK 組，EPO 組IL-6和IL-17的表達(dá)量明顯低于C組和NS組，見表2。

表2 各組血清中IL-6和IL-17表達(dá)比較（mg／L）

3 各組耳蝸組織中IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 表達(dá)比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示:C 組和NS組血清中IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 的表達(dá)量明顯 高 于CK 組，EPO 組IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 的表達(dá)量明顯低于C組和NS組，見表3。

表3 各組耳蝸組織中IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 表達(dá)比較

討 論

老年性耳聾是衰老基礎(chǔ)上出現(xiàn)的聽覺(jué)系統(tǒng)退行性變，主要與隨著年齡的增加，遺傳因素或內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性下降，機(jī)體、器官、組織細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性改變有關(guān)。近年研究顯示炎癥反應(yīng)可能是病變形成的重要機(jī)制［5-6］。隨著機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的下降，機(jī)體中炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，且抑炎介質(zhì)表達(dá)極不穩(wěn)定，可以引起局部耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞逐漸減少及神經(jīng)元發(fā)生退變。也有研究顯示耳蝸是代謝旺盛的組織，對(duì)缺氧敏感，且底部代謝活動(dòng)強(qiáng)于頂部，而老年人基礎(chǔ)代謝率低，對(duì)耳蝸組織的供血供氧量低，因此可以引起局部的炎癥環(huán)境增強(qiáng)，抑炎介質(zhì)形成減少，使毛細(xì)胞的細(xì)胞膜上脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，細(xì)胞通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換紊亂，細(xì)胞自溶，聽力下降［7-8］。EPO 早期主要用于促紅細(xì)胞生成治療貧血，內(nèi)源性EPO 的產(chǎn)生主要是腎臟以低氧依賴的方式進(jìn)行，當(dāng)EPO 生成不足引起腎性貧血，EPO 通過(guò)促使紅系祖細(xì)胞增殖和分化來(lái)調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成，減弱局部的炎癥反應(yīng)［9-10］。它的抗炎和組織保護(hù)在一些自身免疫病及神經(jīng)損傷方面得到關(guān)注。

本研究結(jié)果顯示老年性耳聾小鼠模型血清和耳蝸組織中IL-6和IL-17的表達(dá)明顯高于正常小鼠，EPO干預(yù)后IL-6和IL-17的表達(dá)明顯下降，且與IL-6 m RNA 和IL-17 mRNA 表現(xiàn)出一致性，提示老年性耳聾小鼠耳蝸中IL-6和IL-17高表達(dá)，是病變形成的重要促進(jìn)因子，其高表達(dá)是局部炎性損傷的重要標(biāo)志，是機(jī)體急性免疫應(yīng)答的促發(fā)劑［11-12］。EPO 對(duì)IL-6 和IL-17的表達(dá)有明確的下調(diào)作用，顯示EPO 具有對(duì)抗促炎因子生成的重要作用。近年發(fā)現(xiàn)其具有神經(jīng)保護(hù)、抗細(xì)胞凋亡、促血管形成及減弱炎癥反應(yīng)的作用。也有研究顯示EPO 具有保持線粒體穩(wěn)定，上調(diào)Bcl-2的作用，使局部細(xì)胞凋亡受到影響［13-14］。

EPO 能減少炎癥因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)抑炎因子的分泌，減少外周血中性粒細(xì)胞的數(shù)量，抑制中性粒細(xì)胞激活等［15］。本研究發(fā)現(xiàn)的EPO 下調(diào)IL-6和IL-17的作用為解釋EPO 在應(yīng)用中的抗炎作用提供了重要基礎(chǔ)。

總之，促紅細(xì)胞生成素可以減少老年性耳聾小鼠模型血清和耳蝸組織中IL-6和IL-17的表達(dá)，減少局部的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，對(duì)延緩病變的進(jìn)展及促進(jìn)病變恢復(fù)可能有一定價(jià)值。