薛曉陽 王娟娟 李明珠 王雪敏 李佳佳 （華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司 河北 邯鄲 056000）

2019年初山東某商品蛋雞場(chǎng)130日齡的雞出現(xiàn)零星死亡。臨床癥狀為腿部、腳部、肛周有血泡，疑似血管瘤，但剖檢無腫瘤癥狀。在200日齡檢測(cè)11只弱雞，無菌采集抗凝血進(jìn)行病毒分離工作，培養(yǎng)2代，細(xì)胞上清液經(jīng)ELISAP27抗原檢測(cè)為60%以上陽性，該病例結(jié)合臨床癥狀懷疑為J亞型白血病病例。

禽白血病(A vianleukosis virus，ALV)是由禽C型反錄病毒群的病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，主要是淋巴細(xì)胞性白血病，其次是成紅細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞性白血病。此外還可引起骨髓細(xì)胞瘤、結(jié)締組織瘤、上皮腫瘤、內(nèi)皮腫瘤等。禽白血病的傳播方式分為垂直傳播及水平傳播，其中經(jīng)卵垂直傳播是禽白血病的主要傳播方式，家禽感染禽白血病后可造成雞只生長發(fā)育遲緩、產(chǎn)蛋性能下降、免疫抑制等影響[1]。同品種雞的飼養(yǎng)呈現(xiàn)規(guī)?；?、集約化發(fā)展，蛋雞、地方品種雞感染J亞群ALV的病例報(bào)道不斷增多[2]。禽白血病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失主要有2個(gè)方面：一是產(chǎn)生腫瘤，導(dǎo)致雞的死亡；二是產(chǎn)生非腫瘤綜合征。此外，禽白血病一當(dāng)感染后，可引起雞群的免疫抑制，會(huì)繼發(fā)諸如馬立克氏病、傳染性法氏囊、雞傳貧等免疫抑制病，從而造成更嚴(yán)重的損失[3]。本檢測(cè)病例具有該特點(diǎn)，無明顯腫瘤癥狀，就診斷過程做一分享。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 DF-1細(xì)胞由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)腫瘤與免疫抑制病實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。肝素鈉抗凝管購自江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司。EDTA-K2抗凝管購自山東省成武縣醫(yī)用制品廠。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國康寧公司。DMEM高糖培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家gibco，產(chǎn)品貨號(hào)8119159，有效期至2020.5。0.25胰酶生產(chǎn)廠家gibco，產(chǎn)品貨號(hào)2008319，有效期至2020.9.30。青鏈霉素生產(chǎn)廠家gibco，產(chǎn)品貨號(hào)2068817，有效期2020.1.30。兩性霉素B生產(chǎn)廠家procell，有效期至2020.6。胎牛血清PAA品牌，生產(chǎn)日期SF181212。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱品牌松下，型號(hào)MCO-18AC。倒置顯微鏡品牌NIKON，型號(hào)TS2。高壓滅菌鍋博訊品牌，型號(hào)YXQ-LS-50SII。超純水系統(tǒng)艾科浦公司生產(chǎn)，型號(hào)AWL-0501-H。電熱干燥箱，上海博訊生產(chǎn)，型號(hào)GZX-9140MBE。超凈工作臺(tái)上海博訊公司生產(chǎn)，型號(hào)SW-CT-LFD。醫(yī)用離心機(jī)湘儀設(shè)備，型號(hào)H1850。酶標(biāo)儀BIOTeK品牌，型號(hào)ELX800，洗板機(jī)為BIOTeK品牌，型號(hào)ELX50。移液器，eppendorf品牌。

1.1.3 試劑盒 LLAg試劑盒為IDEXX產(chǎn)品，貨號(hào)LP244，有效期至2020.5.18。

1.1.4 檢測(cè)雞 11只商品蛋雞。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及接種細(xì)胞[4]（1）抗凝血：1500-2000r離心2min，取中間靠下層，注意不要取到紅細(xì)胞.本檢測(cè)使用12孔板接90μl，每孔加入過濾的肝素鈉抗凝劑20μl(12.5U/ml)。（2）接種完 樣品后2h更換維持液，用滅菌的PBS清理清洗細(xì)胞板3次，每孔1ml/次，加入1%細(xì)胞維持液維持5d，維持5d后進(jìn)行傳代。（3）共傳2代，每一代的上清液留樣檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞上清液白血病檢測(cè) 試劑為IDEXX產(chǎn)品，嚴(yán)格按照試劑說明進(jìn)行。

2 檢測(cè)結(jié)果

2.1 細(xì)胞上清液P27蛋白檢測(cè)結(jié)果

表1 2代細(xì)胞培養(yǎng)液P27檢測(cè)結(jié)果

2.2 陽性率及S/P值統(tǒng)計(jì)

表2 陽性率及陽性樣品S/P值統(tǒng)計(jì)

3 討論

（1）檢測(cè)結(jié)果陽性雞只占到檢測(cè)雞只63%以上，并且第一代樣品S/P值較高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于試劑盒 判定標(biāo)準(zhǔn)，且第二代陽性樣品S/P值進(jìn)一步提高，達(dá)到2.16，可以確定為強(qiáng)陽性。可以證明該雞群可能存在大比例陽性雞只，生產(chǎn)性能可能會(huì)受到影響。因?yàn)镈F-1可以排除禽內(nèi)源性白血病檢出，因此檢出的白血病屬于致病性的可能性較大，因該檢測(cè)沒有進(jìn)行后續(xù)病毒分型鑒定，但結(jié)合臨床癥狀初步懷疑是白血病J亞型的一個(gè)血管瘤癥狀。（2）ALV-J引發(fā)的腫瘤/血管瘤給中國養(yǎng)雞業(yè)帶來了很大的危害。在過去十多年里，全國已報(bào)道了100多個(gè)ALV-J毒株的分離鑒定，同時(shí)何愛飛等也有禽白血病所致血管瘤的報(bào)到[5]，王培坤等在三黃雞臨床血管瘤病例分離出A亞群與J亞群白血病病毒 ，說明臨床血管瘤有一定的病例，但是在一般企業(yè)實(shí)驗(yàn)室診斷全面診斷技術(shù)較為困難，病理切片技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，并且在結(jié)果讀取專業(yè)性要求較高，一般企業(yè)員工對(duì)深層次分子理論掌握不夠，PCR方法白血病鑒定對(duì)分子理論要求較高，而細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合ELISA聯(lián)合診斷在企業(yè)應(yīng)用較為適用。（3）結(jié)合本案例白血病臨床解剖不一定有明顯的腫瘤癥狀，11只被檢雞只精神良好，但偏瘦，血管瘤也無很明顯癥狀，臨床從130d開始出現(xiàn)零星死亡，持續(xù)不斷，遠(yuǎn)高于正常死亡標(biāo)準(zhǔn)，從病毒分離結(jié)果，第一代便有高比例陽性檢出，且S/P值較高，因DF-1細(xì)胞可以排除內(nèi)源性感染，因此初步懷疑J亞群白血病的感染，同時(shí)也說明DF-1細(xì)胞結(jié)合ELISA驗(yàn)證，高S/P值也是鑒定標(biāo)準(zhǔn)之一，在臨床檢測(cè)可以攻毒重視。