鄧維琴，肖晴芹，李雄波， 范智義，胡廷，陳功,2，張其圣,2，李恒,2,3*

1(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，四川 成都,611130) 2(四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山,620030) 3(成都市丹丹川菜調(diào)味品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，四川 成都,611730) 4(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都,610106)

郫縣豆瓣是以紅辣椒、蠶豆為主要原料，食用鹽、小麥粉等為輔料，經(jīng)過制曲、甜瓣子發(fā)酵、辣椒醅發(fā)酵及后發(fā)酵生香等階段釀制而成的傳統(tǒng)調(diào)味品[1]。郫縣豆瓣紅棕油亮、味辣香醇、醬香味濃郁，被譽為川菜之魂。郫縣豆瓣生產(chǎn)缺乏專用菌種，目前大部分豆瓣醬生產(chǎn)企業(yè)采用醬油曲精制曲發(fā)酵，然而醬油發(fā)酵為熟料發(fā)酵，豆瓣醬為生料發(fā)酵，兩者的發(fā)酵方式明顯不同，采用醬油發(fā)酵用的菌種發(fā)酵豆瓣醬存在著制曲效果不佳，發(fā)酵速度慢等問題。因此，篩選豆瓣醬發(fā)酵專用米曲霉，開發(fā)一種豆瓣醬專用的曲精對行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

α-淀粉酶在醬類食品發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要的作用，它與糖化酶共同作用分解淀粉產(chǎn)葡萄糖，不僅為醬類食品后期發(fā)酵的酵母菌及其他微生物提供碳源，還是醇類、有機酸類風(fēng)味物質(zhì)形成的前體物質(zhì)，且能與豆瓣醬中的氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生令人愉悅的香氣成分[2-3]。董丹等[4]從郫縣豆瓣中篩選鑒定得到1株芽孢桿菌，所產(chǎn)淀粉酶活力可達80.24 U/mL。周紹琴[5]以貴州傳統(tǒng)豆瓣辣醬為研究對象，從中篩選出高酶活力菌株并探究該菌對產(chǎn)品后熟期的促熟性能，進而證明高酶活力菌株可縮短豆瓣發(fā)酵時間。因此，高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選及應(yīng)用對提升豆瓣醬發(fā)酵速度，優(yōu)化產(chǎn)品品質(zhì)有重要意義。

米曲霉是目前豆瓣醬制曲中普遍應(yīng)用的菌株，且產(chǎn)α-淀粉酶能力強。DEY等[6]優(yōu)化米曲霉IFO-30103培養(yǎng)條件后產(chǎn)淀粉酶能力可達1 000 U/mg。SAHNOUN等[7]從一種甜醬中篩選出1株產(chǎn)淀粉酶的米曲霉，優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵條件后，培養(yǎng)液中α-淀粉酶酶活力可達1 220 U/mL[8]。然而關(guān)于郫縣豆瓣高產(chǎn)α-淀粉酶米曲霉的篩選及在豆瓣醬發(fā)酵中的應(yīng)用還鮮見報道。本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵郫縣豆瓣醬原料篩選高產(chǎn)α-淀粉酶米曲霉，對高效產(chǎn)酶菌株進行鑒定。由于黃曲霉和米曲霉基因相似度很高，因此2者極容易混淆，僅通過ITS(internal transcribed spacer)序列測定很難將二者區(qū)分[9]。黃曲霉菌株是代謝黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的重要污染微生物，在食品領(lǐng)域受到極大的重視。由于鑒定方法不完善，有的菌株即使被鑒定為米曲霉，仍有可能會代謝產(chǎn)生黃曲霉毒素[10]。因此，對米曲霉應(yīng)用菌株進行多相鑒定，徹底區(qū)分黃曲霉和米曲霉，菌株產(chǎn)黃曲霉毒素能力的評價對高產(chǎn)淀粉酶菌株的推廣應(yīng)用具有重要意義。本研究從傳統(tǒng)的豆瓣曲中篩選α-淀粉酶活力較高的菌株，通過ITS測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)合形態(tài)觀察，菌株產(chǎn)AFB1基因擴增及產(chǎn)AFB1可能性測定對菌株進行多項鑒定，評價其推廣應(yīng)用的可行性。

1 材料和試劑

1.1 原料

以傳統(tǒng)制曲的豆瓣曲、傳統(tǒng)發(fā)酵的甜瓣子為菌株篩選原料。

1.2 培養(yǎng)基

PD培養(yǎng)基：馬鈴薯削皮，切塊，稱取200 g，添加500 mL蒸餾水，煮沸30 min，紗布過濾后取濾液；加入20 g葡萄糖，溶解后補加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

淀粉酶篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨2 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，K2HPO43 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

黃豆汁固體培養(yǎng)基：將除雜后的黃豆浸泡4 h以上，煮沸5 h。用紗布過濾后取黃豆汁1 L(調(diào)整濾液至5 Bé)，20 g可溶性淀粉，1 g KH2PO4，0.5 g MgSO4，0.5 g (NH4)2SO4，20 g瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

麩皮固體培養(yǎng)基：m(麩皮)∶m(黃豆粉)∶m(水)=4∶1∶4混合，浸潤30 min，拌勻。用1 L錐形瓶分裝，60 g/瓶，121 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)毒培養(yǎng)基(AFPA)：蛋白胨 10 g，酵母粉 20 g，檸檬酸鐵 0.5 g，四氯醌 0.002 g，氯霉素15 g，瓊脂 15 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.3 主要試劑

可溶性淀粉、KI、I2，成都金山化學(xué)試劑有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4和甲醛(分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；H2SO4，四川西隴化工有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，TaqPCR Master Mix，生工生物工程股份有限公司；乳酸酚棉藍染液，北京索萊寶科技有限公司。黃曲霉毒素檢測試劑盒，深圳芬德生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器和設(shè)備

752G紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器股份有限公司；DYY-6D電泳儀,北京六一生物科技有限公司；BCD-201MLT冰箱,合肥美菱股份有限公司；H2050R-1離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司；PHSJ-4型pH計,上海儀電分析儀器股份有限公司；T960A智能梯度PCR儀,杭州晶格科學(xué)儀器有限公司； 霉菌培養(yǎng)箱,BMJ-250C、Multiskan FC型酶標儀,美國Thermo賽默飛世爾；LDZF-75KB型立體壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠。

2 實驗方法

2.1 高產(chǎn)淀粉酶霉菌的篩選

2.1.1 初篩

取25 g樣品，梯度稀釋，涂布于孟加拉紅平板，28 ℃培養(yǎng)48 h；挑取菌株劃線于PDA培養(yǎng)基進行純化。將分離純化后的菌株點植于淀粉酶篩選平板，28 ℃培養(yǎng)72 h，噴灑稀碘液于菌落表面，觀察培養(yǎng)基透明圈。用游標卡尺測量菌落直徑和透明圈直徑，根據(jù)菌落直徑與透明圈直徑的比值初步篩選出產(chǎn)α-淀粉酶能力強的菌株，劃線于PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)72 h，4 ℃保存。

2.1.2 復(fù)篩

將初篩得到產(chǎn)淀粉酶能力強的菌株接種于麩皮培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)16 h后，將其搖散繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后進行第2次搖瓶，36 h時曲料結(jié)為較緊實的餅狀，此時應(yīng)扣瓶培養(yǎng)至72 h，測定麩皮曲精中α-淀粉酶活力。

α-淀粉酶活力的測定參考徐歡歡[11]的測定方法。淀粉酶活力單位定義為：40 ℃，pH 6.0條件下5 min內(nèi)水解1 mg淀粉的酶量，以U/g表示。

粗酶液制備：稱取麩皮曲精10 g，加入200 mL磷酸緩沖溶液(pH 6.0)，40 ℃水浴浸提1 h，間歇攪拌，過濾備用。

測定方法：移取5 mL可溶性淀粉溶液，在40 ℃水浴中預(yù)熱10 min，加入0.5 mL粗酶液，40 ℃水浴振蕩，準確反應(yīng)5 min，加入5 mL 0.1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；取0.5 mL反應(yīng)液與5 mL碘液顯色，將反應(yīng)液加入酶標儀的多孔板中測定OD620 nm值。以0.5 mL蒸餾水替代0.5 mL反應(yīng)液為空白組，相同體積的緩沖液代替酶液反應(yīng)為對照組。淀粉酶活力根據(jù)公式(1)計算：

(1)

式中：R0,對照組與碘液反應(yīng)的吸光值；R,反應(yīng)液與碘液反應(yīng)的吸光值；D,粗酶液的稀釋倍數(shù)。

2.2 高產(chǎn)淀粉酶的霉菌鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察

菌落形態(tài)：將所選菌株點殖于黃豆汁培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h后觀察菌株形態(tài)。

顯微形態(tài)：挑取菌株的孢子及菌絲采用乳酸酚棉藍染液進行染色制片，采用250VX2雙目生物顯微鏡觀察菌絲、頂囊及孢子著陸形態(tài)。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

將菌株接種于黃豆汁固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h。挑取菌絲，采用液氮研磨后，用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取霉菌DNA。以此DNA為模板，以ITS1、ITS4為引物擴增霉菌ITS片段，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chainreaction, PCR)體系為30 μL：ddH2O 12.5 μL、上下引物各1 μL、DNA模板3 μL、Mix酶12.5 μL。擴增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性保持4 min；94 ℃變性1 min、60 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增樣品送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。測序得到的序列通過BLAST比對，采用Mega 5.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹對菌株進行鑒定。

2.2.3 產(chǎn)毒培養(yǎng)基(AFPA)檢測方法

將菌株點植于AFPA固體培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng)2～3 d，觀察AFPA培養(yǎng)基上的特征并記錄。

2.2.4 產(chǎn)毒基因檢測方法

選取4個黃曲霉毒素合成的關(guān)鍵基因進行PCR擴增檢測，四者在黃曲霉毒素合成通路中都是必須的，包括調(diào)控aflO,aflP和aflQ,tub1[12]，擴增引物序列如表1所示。

表1 AFB1 關(guān)鍵基因擴增引物Table 1 Amplification primer AFB1 key gene

aflO、aflP和aflQ、tub1 PCR擴增條件：94 ℃ 預(yù)變性4 min； 94 ℃變性1 min， 60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min; 5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸6 min。

2.2.5 菌株產(chǎn)黃曲霉毒素能力測定

接種4株菌株于PD液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)180 h，采用ELISA試劑盒測定發(fā)酵液中AFB1含量。具體檢測方法如下：

(1)取2 mL發(fā)酵液，加入2 mL蒸餾水，7 mL甲醇，振蕩5 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液進行分析。

(2)取出適量微孔板，加入50 μL標準品/樣本。

(3)加入AFB1酶標物50 μL /孔，同時加入抗體試劑50 μL /孔。

(4)蓋板膜蓋板后，至25 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min。

(5)反應(yīng)完成后將液體甩干，接著用洗滌液300 μL/孔充分洗滌4～5次。

(6)加入底物A液50 μL /孔，并加入底物B液50 μL /孔。

(7)蓋板膜蓋板后，至25 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min。

(8)加入終止液50 μL /孔后用450的酶標儀測定每孔OD值。

2.3 數(shù)據(jù)分析

采用excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，實驗結(jié)果中的數(shù)據(jù)均為3個平行樣品均值，相對標準偏差在表和圖中分別以數(shù)值和誤差棒表示，采用origin 9.1作圖分析。采用SPASS進行鄧肯分析，置信區(qū)間為95%。

3 結(jié)果與分析

3.1 初篩

篩選得到70株霉菌，于淀粉酶篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中35株霉菌能在淀粉酶篩選平板產(chǎn)生透明圈，分別測量這35株菌的透明圈直徑d及菌落直徑D，計算比值，結(jié)果如表2所示。菌株30M-1的d/D值最大，達到3.128。其次為BM-2、BM-5、25M-1、14、DM2、16、19、DM1、18M-1、24，d/D值都大于2.000。

表2 菌株菌落直徑與透明圈直徑測定結(jié)果Table 2 Results of bacterial colony diameter and transparent circle diameter

3.2 α-淀粉酶活力測定結(jié)果

對上述35株霉菌于麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到麩曲后測定其α-淀粉酶活力，測定結(jié)果如表3所示。供試菌株中，曲霉30M-1為產(chǎn)α-淀粉酶最高的菌株，所產(chǎn)淀粉酶活力高達3 496.915 U/g。此外，菌株DM1、16、DM2、19、14產(chǎn)淀粉酶活力也可達到2 000 U/g以上。篩選菌株淀粉酶活力強，遠高于目前已報道的菌株，選取產(chǎn)α-淀粉酶活力最強的30M-1、FN、DM2、16四株霉菌進行鑒定研究，為其推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

表3 α-淀粉酶活力測定結(jié)果Table 3 Results of alpha amylase activity determination

注：t檢驗P<0.05表示樣品間差異顯著，不同字母代表差異顯著

3.3 菌株鑒定結(jié)果

3.3.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

4株菌于28 ℃培養(yǎng)96 h后，菌株形態(tài)相似，如圖1所示。菌株16菌落呈黃綠色，質(zhì)地呈絲絨狀，中央凸起；菌株30M-1呈現(xiàn)黃綠色，表面平坦；菌株DM2為黃綠色，顏色較深，中央凸起，表面具有放射狀褶皺；菌株FN為黃綠色，菌絲較短，疏松。

圖1 菌株形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strains

顯微鏡形態(tài)觀察，如圖2所示，所選4株菌的孢梗莖壁薄且長，壁平滑，其分生孢子為圓形。頂囊呈球形，由頂囊的小梗產(chǎn)生孢子，分生孢子頭輻射狀，未發(fā)現(xiàn)菌核的形成。結(jié)合白飛榮等[15-16]對米曲霉的鑒定研究結(jié)果，初步判斷篩選出的4株菌均為米曲霉。

圖2 顯微產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)Fig.2 Microscopic characteristics of conidia

3.3.2 菌株分子學(xué)鑒定結(jié)果

測序結(jié)果提交NCBI進行BLAST序列同源性比對，采用MEGA 5.0利用鄰近法構(gòu)建進化樹，其結(jié)果如圖3所示。4株菌株ITS序列相似度高，聚為一類；4株菌株均能與米曲霉，黃曲霉模式菌株聚為一類，說明和二者的相似度均較高。

圖3 試驗菌株系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of experimental strains

3.3.3 產(chǎn)毒培養(yǎng)基(AFPA)檢測結(jié)果

PITT等[17]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)毒的黃曲霉、寄生曲霉在AFPA培養(yǎng)基上，菌落反面呈明顯橙黃色，而不產(chǎn)毒的米曲霉AFPA培養(yǎng)基上菌落反面則呈黃褐色或淺黃色。將驗菌株三點接種于AFPA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，菌株背面形態(tài)如圖4所示。

圖4 菌株AFPA培養(yǎng)特征Fig.4 Strain’s characteristic on AFPA

4株菌株于AFPA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后菌落反面為黃褐色，說明菌株不產(chǎn)黃曲霉毒素。這與白飛榮等[15]研究米曲霉模式菌株在AFPA上培養(yǎng)的結(jié)果一致。

3.3.4 產(chǎn)AFB1關(guān)鍵基因

4種關(guān)鍵基因擴增結(jié)果如圖5所示。4株菌株均擴增出部分產(chǎn)AFB1的關(guān)鍵基因。菌株30M-1為模板未擴增出Aflp基因，而菌株16、FN、DM2擴增出了試驗的4種基因。黃曲霉毒素合成基因簇包含 25 個基因，長度大約 70 kb[18]。部分米曲霉菌株含有產(chǎn)毒基因，但基因發(fā)生突變、缺失或堿基替換，不能正常表達。黃曲霉菌株含有產(chǎn)毒基因，大部分正常表達，產(chǎn)黃曲霉毒素；部分菌株因產(chǎn)毒基因發(fā)生突變，不能正常表達產(chǎn)生黃曲霉毒素[16,19]。菌株是否產(chǎn)毒需要進一步進行產(chǎn)毒試驗驗證。

圖5 產(chǎn)AFB1關(guān)鍵基因擴增結(jié)果Fig.5 PCR amplicons of AFB1 genes

3.3.5 菌株培養(yǎng)液AFB1檢測結(jié)果

菌株DM2、FN、16、30 M-1發(fā)酵液中未檢出AFB1，因此沒有黃曲霉毒素污染風(fēng)險。

本試驗中雖然試驗的大部分AFB1關(guān)鍵基因均在檢測的4株菌株DNA中擴增出，但菌株發(fā)酵液中AFB1檢測結(jié)果顯示，4株菌均不產(chǎn)AFB1，說明基因無法正常表達。

4 討論

米曲霉、醬油曲霉等有益霉菌由于高產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶等特性被廣泛應(yīng)用于醬油，大醬等產(chǎn)品的發(fā)酵[20]。淀粉酶分解淀粉類物質(zhì)為小分子物質(zhì)，對后期的發(fā)酵及風(fēng)味形成具有重要意義。本文篩選的霉菌產(chǎn)淀粉酶能力強，其中菌株30M-1發(fā)酵麩皮曲中α-淀粉酶活力為3 496.915 U/g，F(xiàn)N、DM2、16發(fā)酵麩皮曲中α-淀粉酶活力分別為2 490.185、2 540.606和2 305.104 U/g。菌株于麩皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)均生長良好，產(chǎn)生淀粉酶的能力高于目前報道的菌株。且菌株從傳統(tǒng)發(fā)酵的豆瓣曲及甜瓣子中篩選得到，適合于豆瓣醬發(fā)酵環(huán)境中生長，有應(yīng)用于豆瓣醬發(fā)酵的潛力。

目前許多米曲霉(或者類似米曲霉的菌株)僅通過簡單的鑒定，未通過安全性評價就應(yīng)用于食品的發(fā)酵。然而米曲霉和黃曲霉菌株在分類學(xué)上非常接近，僅通過簡單的ITS測序或者形態(tài)觀測很難將二者進行區(qū)分，二者極容易被混淆，所以在應(yīng)用過程中很容易爆發(fā)黃曲霉毒素的污染，導(dǎo)致發(fā)酵食品中黃曲霉毒素檢出的情況[21-22]。因此，篩選發(fā)酵應(yīng)用的菌株，對菌株進行徹底地鑒定及安全性評價是必須的。CHRISTENSE[23]提出，米曲霉是野生黃曲霉種的馴化種，CHANG等[19]認為米曲霉是黃曲霉的形態(tài)學(xué)變種，二者同屬于曲霉屬黃綠組，形態(tài)相近、基因組高度相似[24]，因此曲霉黃綠組菌株的鑒定需要結(jié)合基因測序，形態(tài)鑒定及產(chǎn)毒能力進行綜合分析。

本文篩選的4株高產(chǎn)淀粉酶的霉菌，通過菌落形態(tài)及顯微形態(tài)鑒定菌株為米曲霉；通過ITS測序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示菌株和米曲霉和黃曲霉相似度高，均能聚為一類。綜合菌株產(chǎn)毒能力測定結(jié)果分析顯示，本文篩選的4株高產(chǎn)淀粉酶的菌株與米曲霉同源性近，不產(chǎn)AFB1。

5 結(jié)論

本研究篩選得到4株高產(chǎn)α-淀粉酶的霉菌，固態(tài)發(fā)酵麩皮培養(yǎng)基中α-淀粉酶活力均大于2 000 U/g，其中菌株30M-1固態(tài)發(fā)酵麩皮培養(yǎng)基中α-淀粉酶活達到3 496.915 U/g。4株菌在PDA培養(yǎng)基中菌落均為黃綠色，顯微結(jié)構(gòu)與米曲霉結(jié)構(gòu)相似，無菌核產(chǎn)生。AFPA產(chǎn)毒培養(yǎng)基中培養(yǎng)背面為橙黃色，無AFB1產(chǎn)生。ITS測序構(gòu)建進化樹均聚為一類，與黃曲霉和米曲霉模式菌株相似度大于99%。4株菌均能擴增出部分產(chǎn)AFB1關(guān)鍵基因，但發(fā)酵液中未檢出AFB1，說明基因不能正常表達。多相鑒定結(jié)果顯示篩選的4株高產(chǎn)淀粉酶的霉菌與米曲霉更相似，沒有造成AFB1污染的風(fēng)險，可以作為豆瓣醬發(fā)酵的備用菌株。