李陳晨，賴鳳羲，夏永軍，艾連中，張匯

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海，200093)

正紅菇(Russulavinosa)屬真菌界(Eumycetes)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、紅菇科(Russulaceae)，分布于世界各地，尤其是溫帶地區(qū)。目前已知的紅菇屬真菌有750余種，我國就有150多種[1]。紅菇味甘性溫，含有大量生物活性成分，如紅菇多糖、麥角甾醇、有機(jī)酸、酚類等[2]，其子實(shí)體提取物在調(diào)節(jié)生長[3]、增強(qiáng)免疫力[4]、降血糖[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]等方面具有良好的功效。但紅菇的菌絲不易分離，人工栽培難度較大，所以十分珍貴。

已有許多文獻(xiàn)報(bào)道了紅菇多糖的生物活性，如KHATUA等[8]證明了堿提紅菇粗多糖具有較好的抗氧化活性；LIU等[7]發(fā)現(xiàn)水提紅菇多糖能夠增強(qiáng)HeLa和SiHa細(xì)胞的凋亡率。巨噬細(xì)胞常用作研究化合物免疫調(diào)節(jié)特性的重要細(xì)胞模型[9]，當(dāng)機(jī)體受到病理刺激或損傷時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的生物活性分子，包括NO和細(xì)胞因子[10]。但現(xiàn)有研究主要集中在單一提取方式所得紅菇多糖的活性，關(guān)于分步提取紅菇不同部位(菌蓋和菌柄)多糖化學(xué)成分及活性之間差異的報(bào)道很少，因此不能確定表現(xiàn)出良好生物活性的紅菇多糖有效成分獲取方法。

本研究為了探討分步提取正紅菇不同部位多糖提取物的差異，將紅菇子實(shí)體分為菌蓋和菌柄，并依次采用熱水浸提和堿液提取的方法，得到4種多糖提取物：菌蓋多糖水提物(WCP)、菌蓋多糖堿提物(ACP)、菌柄多糖水提物(WSP)和菌柄多糖堿提物(ASP)。采用高效體積排阻色譜串聯(lián)多角度激光光散射儀(high performance size exclusion chromatography coupled with multiple angle laser light scattering, HPSEC-MALLS)和高效陰離子交換色譜(high performance anion exchange chromatography, HPAEC-PAD)，分別測定了不同部位紅菇多糖提取物的分子質(zhì)量分布和單糖組成，并研究了4種多糖提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫活性的影響，為正紅菇資源的高效開發(fā)和高值化利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正紅菇干品產(chǎn)自福建武夷山；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品：巖藻糖(Fuc)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)、果糖(Fru)、半乳糖(Gal)、核糖(Rib)、半乳糖醛酸(GalA)和葡萄糖醛酸(GlcA)，美國Sigma 公司；一氧化氮(NO)檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素-鏈霉素雙抗，維森特生物技術(shù)(南京)有限公司；小鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒，上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司；脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、中性紅等均為國產(chǎn)分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 型高效液相色譜儀,美國Agilent公司；HPSEC-MALLS 多角度激光光散射儀,美國WYATT公司；ICS-5000離子色譜儀,美國Thermo公司；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅菇多糖提取物的制備

正紅菇子實(shí)體菌蓋、菌柄分開后，分別粉碎、過80目篩，得到2個(gè)部位的菌粉。菌粉加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇過夜脫色、離心，沉淀于80 ℃水浴中攪拌提取3 h并重復(fù)提取1次，提取液分別旋蒸濃縮、透析、醇沉，離心后沉淀真空干燥得到WCP和WSP。水提后殘?jiān)^續(xù)采用0.5 mol/L NaOH/0.01 mol/L NaBH4溶液室溫下提取12 h，提取液采用上述同樣的方法處理，得到ACP和ASP?？偺呛坎捎帽椒?硫酸法[11]測定，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法[12]測定，總酚含量采用福林酚法[13]測定，糖醛酸含量采用間羥基聯(lián)苯顯色法[14]測定，提取率按照公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：m1,真空干燥后所得多糖提取物的質(zhì)量;m0,干燥菌粉的質(zhì)量。

1.3.2 紅菇多糖提取物的分子質(zhì)量分布

采用高效體積排阻色譜串聯(lián)DAWNHELEOS-II多角度激光光散射器、Optilab T-rEX示差折光檢測器、G7114A紫外檢測器和ViscoStar-II差壓式黏度檢測器,分析多糖的分子質(zhì)量分布、固有黏度[η]和回旋半徑Rg等參數(shù)[15]。色譜柱 OHpak SB-805HQ (8.0 mm×300 mm)和OHpak SB-803HQ (8.0 mm×300 mm)串聯(lián)；流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3；流速0.6 mL/min；柱溫40 ℃；紅菇多糖樣品用流動(dòng)相配制成1 mg/mL的溶液；進(jìn)樣體積100 μL；使用ASTRA 7.1.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析。

1.3.3 單糖組成分析

采用Thermo ICS-5000高效陰離子交換色譜串聯(lián)脈沖安培檢測器(high performance anion exchange chromatography coupled with pulsed amperometric detector, HPAEC-PAD)分析樣品的單糖組成，色譜柱 CarboPacTMPA20(3 mm×150 mm)。流動(dòng)相A為超純水，B為250 mmol/L的NaOH溶液，C為1 mol/L的NaOAc溶液，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序參照ZHANG等[16]并進(jìn)行適當(dāng)修改。

稱取樣品5 mg于具塞試管中，冰浴條件下加入0.5 mL濃H2SO4，室溫反應(yīng)30 min，緩慢加水將H2SO4稀釋至2 mol/L，混勻后于100 ℃的油浴中水解2 h。取出迅速冷卻，稀釋50倍后，用0.22 μm微孔膜過濾并進(jìn)樣分析。10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下進(jìn)行定性和定量分析。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

使用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7評(píng)估正紅菇多糖提取物的免疫活性。RAW264.7培養(yǎng)在新鮮配制的DMEM完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)中，體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃。將對(duì)數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至1×105個(gè)/mL，用于細(xì)胞增殖率、中性紅吞噬能力、NO產(chǎn)生量以及細(xì)胞因子的測定。其中未加多糖干預(yù)(完全培養(yǎng)基)的為陰性對(duì)照組，含有系列濃度(10、50、100、200 μg/mL)多糖樣品的作為實(shí)驗(yàn)組，1 μg/mL的脂多糖(lipopoly-saccharides, LPS)作為陽性對(duì)照，每組平行6～8次。

1.3.5 細(xì)胞增殖情況

取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞懸浮液，以100 μL/孔接種到96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，然后在細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入20 μL質(zhì)量濃度5 mg/mL的噻唑藍(lán)3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄上清培養(yǎng)基，向每孔中加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，低速搖勻10 min使藍(lán)紫色結(jié)晶物完全溶解，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度，細(xì)胞增殖率按照公式(2)計(jì)算[17]。

(2)

式中：At,實(shí)驗(yàn)組(或陽性對(duì)照組)吸光度;Ac,陰性對(duì)照組吸光度。

1.3.6 Griess 法測定NO

采用一氧化氮檢測試劑盒分析4種樣品對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO量的影響。取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞懸浮液，以100 μL/孔接種到96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，取上清液50 μL于另一個(gè)96孔板中，室溫下分別加入試劑盒中Griess試劑I和試劑II，輕輕混勻后，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度。根據(jù)試劑盒中NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品NO的含量。

1.3.7 中性紅吞噬能力

取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞懸浮液，以100 μL/孔接種到96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后棄上清，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%中性紅生理鹽水溶液100 μL，培養(yǎng)4 h后棄上清，用PBS洗2遍，加入100 μL細(xì)胞裂解液[V(乙醇)∶V(冰醋酸)=1∶1]，避光反應(yīng)2 h，在酶標(biāo)儀上測定540 nm處吸光度值[18]，吸光度的大小直接反應(yīng)巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬能力。

1.3.8 細(xì)胞因子檢測

采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α的含量[19]。取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞懸浮液，以100 μL/孔接種到96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 后取上清，往預(yù)先包被細(xì)胞因子捕獲抗體的微孔中，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)、HRP標(biāo)記的檢測抗體，溫育后加入底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl-benzidine, TMB)顯色，酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中細(xì)胞因子的濃度。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

除細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外，其他實(shí)驗(yàn)平行測量3次。數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS statistics 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及多重比較分析，P<0.05為差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅菇多糖提取物的化學(xué)成分

WCP、ACP、WSP和ASP主要是由中性糖組成，還含有一定量的蛋白質(zhì)和少量酚類物質(zhì)，具體結(jié)果見表1。

4種紅菇多糖提取物的糖醛酸含量均較低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為3.02%，而蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在8%左右，但相同部位多糖堿提物的含量略高于水提物，這可能是由于堿性環(huán)境促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶出。紅菇多糖水提物的提取率、總糖含量、總酚含量均高于對(duì)應(yīng)部位的堿提物，其中WSP的提取率和總糖含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是6.25%和75.17%；WCP總酚含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.78%。綜上，相同提取方式得到的菌蓋與菌柄多糖提取物，其化學(xué)成分相似，但相同部位的水提物與堿提物的化學(xué)成分存在一定差異。

表1 不同部位紅菇多糖的提取率和化學(xué)成分Table 1 The extraction yield and chemical composition of different parts of Russula vinosa polysaccharides

2.2 紅菇多糖提取物的分子質(zhì)量分布

HPSEC-MALLS可以得到高分子聚合物的絕對(duì)分子質(zhì)量、分子質(zhì)量分布等[15]。聚合物的散射光強(qiáng)度(light scattering, LS)取決于分子的尺寸和濃度；而示差折光(refractive index, RI)信號(hào)與樣品濃度直接相關(guān)，兩者串聯(lián)可以表征多糖的回旋半徑(radius of gyration,Rg)等分子尺寸參數(shù)。

a-光散射信號(hào);b-示差折光信號(hào);1-WCP;2-ACP;3-WSP;4-ASP圖1 四種紅菇多糖提取物的HPSEC色譜圖Fig.1 HPSEC chromatogram of four Russula vinosapolysaccharide fractions

4種紅菇多糖提取物的RI信號(hào)峰分布較寬，WCP與WSP出現(xiàn)多個(gè)色譜峰且峰型相似(圖1-b)，表明菌蓋和菌柄中的水提物分子質(zhì)量及其分布無顯著性差異。紅菇多糖水提物中存在多種分子質(zhì)量分布的色譜峰，且水提物的多分散系數(shù)(Mw/Mn)略高于堿提物，表明水提物中多糖分子質(zhì)量分布較寬。圖1可以看出，4種樣品中主要的大分子多糖分布相對(duì)集中，呈均一對(duì)稱色譜峰，并且均在25.8 min前出峰，由此計(jì)算提取物中主要組分的分子質(zhì)量、回旋半徑(Rg)等參數(shù)(表2)，結(jié)果表明：紅菇多糖堿提物的重均分子質(zhì)量(Mw)、數(shù)均分子質(zhì)量(Mn)、固有黏度([η])和回旋半徑(Rg)均小于對(duì)應(yīng)部位的水提物，這可能是由于堿性環(huán)境促使大分子多糖發(fā)生降解，從而引起分子大小及理化性質(zhì)的改變，這將導(dǎo)致其生物活性存在差異[20]。此外，WCP的主要組分還存在含量較低的大分子信號(hào)峰，推測其可能是由于多糖分子之間形成聚集體造成的[15]。

表2 不同部位紅菇多糖主要組分的分子參數(shù)Table 2 Molecular parameters of main components ofdifferent parts of Russula vinosa polysaccharides

2.3 單糖組成

通過HPAEC-PAD分析，得到10種混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖2-a所示。相同條件下，測得WCP、ACP、WSP、ASP均主要由葡萄糖組成，含有少量半乳糖和甘露糖(圖2-b)。

菌蓋多糖水提物WCP的單糖組成為葡萄糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)78.4%)、半乳糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.5%)和甘露糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.3%)，堿提物ACP具有相似的組分，但半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低至6.2%，甘露糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到9.6%；菌柄多糖提取物也具有同樣的變化趨勢(表3)。該結(jié)果表明，與水提物相比，對(duì)應(yīng)部位紅菇多糖堿提物其半乳糖含量降低、甘露糖含量升高，即不同提取方式得到多糖提取物的單糖組成種類相同，但比例具有顯著差異，這些差異可能會(huì)影響多糖提取物的生物活性[20]。菌蓋和菌柄部位的多糖組成相似，這表明紅菇菌柄和菌蓋部位多糖提取物的單糖組成無顯著差異。

a-10種混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品;b-紅菇多糖提取物圖2 十種混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品(a)以及紅菇多糖提取物(b)的離子色譜圖Fig.2 The HPAEC chromatogram of 10 mixed monosacch-aride standards(a) and Russula vinosa polysaccharide extracts(b)

表3 不同部位紅菇多糖提取物的單糖組成比較Table 3 Comparison of monosaccharide compositions ofdifferent parts of Russula vinosa polysaccharides extracts

2.4 MTT法測定巨噬細(xì)胞增殖率

采用MTT法測定了4種紅菇多糖提取物對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同部位紅菇多糖提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響Fig.3 Effect of different parts of Russula vinosapolysaccharides extracts on the proliferation rate of RAW264.7 cells

WCP和WSP作用效果相似，均能顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，且隨著多糖濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢，雖然WCP濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率表現(xiàn)出了輕微的下降，但水提物組巨噬細(xì)胞的增殖率普遍高于堿提物組。相比之下，盡管ACP和ASP對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖沒有明顯劑量依賴性，但仍有輕微的增殖且2組增殖效果相似?？傊?，WCP、ACP、WSP和ASP的細(xì)胞增殖率均為正值，表明4種紅菇多糖提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖具有一定的促進(jìn)作用。

2.5 Griess法測定NO

巨噬細(xì)胞釋放NO量的多少，可以間接反映其發(fā)揮非特異性免疫的強(qiáng)弱[21]。由圖4可知，不同部位紅菇多糖提取物刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的量各不相同，但都表現(xiàn)出了一定的劑量依賴性。隨著多糖濃度的增加，RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的量呈上升趨勢。其中，紅菇多糖水提物WCP和WSP的效果較為顯著，而堿提物ACP與ASP作用效果次之。以上結(jié)果表明，與紅菇多糖堿提物相比，多糖水提物可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的NO，從而較好的發(fā)揮免疫效應(yīng)；而相同提取方式下，紅菇菌蓋與菌柄多糖提取物對(duì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO的能力無顯著差異。

圖4 不同部位紅菇多糖提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響Fig.4 Effect of different parts of Russula vinosa polysacc-harides extracts on NO production in RAW264.7 cells注：與陰性對(duì)照組相比，*,差異顯著(P<0.05)，**,差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.6 中性紅吞噬能力

巨噬細(xì)胞的吞噬能力是反映細(xì)胞免疫活性的一個(gè)重要指標(biāo)。從圖5可以看出，不同部位紅菇多糖提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響不同。與對(duì)照LPS相比，除ACP對(duì)中性紅吞噬率無明顯變化外，其余3種多糖提取物都能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅，且都表現(xiàn)出一定的劑量依賴性；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，WCP、WSP和ASP均具有顯著性影響。

圖5 不同部位紅菇多糖提取物對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響Fig.5 Effect of different parts of Russula vinosapolysaccharides extracts on macrophage phagocytosis indicated by neutral red assay

以上結(jié)果表明，除了ACP外，其他另外3種紅菇多糖提取物均能增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力，且作用效果相似。

2.7 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子被誘導(dǎo)之后，會(huì)引發(fā)免疫系統(tǒng)的抗病反應(yīng)，并有助于增強(qiáng)免疫反應(yīng)[22]。與陰性對(duì)照組相比，4種紅菇多糖提取物均能顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-1β(圖6-b)；除ASP外，其余3種多糖均能顯著促進(jìn)TNF-α的分泌量(圖6-a)。與ACP和WSP相比，WCP對(duì)2種細(xì)胞因子的分泌量均有一定程度的提高，具有明顯的劑量依賴性。與ASP相比，WSP能刺激RAW264.7細(xì)胞釋放較多TNF-α和IL-1β；且隨著WSP質(zhì)量濃度的增加，TNF-α的分泌量逐漸增加，盡管IL-1β的量保持穩(wěn)定，但均高于ASP組。此外，隨著ASP質(zhì)量濃度的增加， TNF-α的分泌量表現(xiàn)出小幅度下降趨勢。綜上，紅菇多糖水提物比堿提物能更顯著地促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)TNF-α和IL-1β的分泌，且菌蓋多糖略優(yōu)于菌柄多糖。

a-細(xì)胞因子TNF-α;b-細(xì)胞因子IL-1β圖6 不同部位紅菇多糖提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Fig.6 Effect of different parts of Russula vinosapolysaccharides extracts on cytokine secretion of RAW264.7 cells

3 結(jié)論

本研究依次利用熱水和堿液提取正紅菇菌蓋和菌柄多糖，得到WCP、WSP、ACP和ASP 4種多糖提取物。從化學(xué)組成和分子質(zhì)量方面進(jìn)行比較，在相同提取方式下，菌蓋和菌柄多糖提取物的化學(xué)成分、分子質(zhì)量、回轉(zhuǎn)半徑以及單糖組成等均無顯著差異；而同一部位的水提物與堿提物，其總糖含量、分子質(zhì)量、固有黏度、回轉(zhuǎn)半徑以及單糖組成等具有顯著差異，從而推測正紅菇多糖提取物的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征與提取部位相關(guān)性小，而與提取方式相關(guān)性大。體外細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)表明：一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，正紅菇菌蓋和菌柄部位的多糖水提物在促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖、吞噬作用以及NO和細(xì)胞因子(如TNF-α和IL-1β)的釋放量等方面，比對(duì)應(yīng)的堿提物更具優(yōu)勢，推測其可能是由于正紅菇多糖水提物與堿提物的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)差異所致。本研究為紅菇多糖進(jìn)一步在食品和保健品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論參考，水提紅菇多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及免疫活性機(jī)理可作為后續(xù)研究重點(diǎn)。