申意偉 徐西林 張曉峰 李雪 呂航 張騁 白洋 李佐峰 范楨亮 趙軍

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;3.東北師范大學(xué)數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024

酒精消費(fèi)已成為全球最嚴(yán)重的藥物濫用障礙之一。慢性長(zhǎng)期酒精攝入對(duì)多種器官有害，包括大腦、心臟、肝臟、肌肉和骨骼[1-3]。雖然最近的研究表明，適量酒精攝入可能對(duì)骨性能和礦物質(zhì)密度有益[4]，但短期過(guò)量或長(zhǎng)期慢性酒精攝入可能與骨重建受損和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加呈正相關(guān)[5]，甚至導(dǎo)致骨壞死發(fā)生[6-7]。骨骼生物力學(xué)作為評(píng)價(jià)骨結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)特性的重要方法[8-9]，從生物力學(xué)角度探討酒精對(duì)骨組織的影響，尤其是對(duì)股骨頭的影響，具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10周齡雄性 SD大鼠35只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(275±12)g，由遼寧沈陽(yáng)長(zhǎng)生科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。屏障系統(tǒng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(黑)2016004]條件下，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，周期照明，室內(nèi)室溫 20～25 ℃，相對(duì)濕度 40%～70%，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲食和飲水。

1.2 主要試劑和儀器

電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(Instron 5569，英斯特朗-美國(guó))，哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心擁有；精密游標(biāo)卡尺，精密度0.001 mm(上海首豐精密儀器有限公司)；精密切割機(jī)器(ZQ-50智能精密切割機(jī)，天津帝誠(chéng)聯(lián)碩科技有限公司)；無(wú)水乙醇(上海振興化工一廠)，無(wú)菌蒸餾水稀釋制成體積分?jǐn)?shù)為46%的酒精溶液。

1.3 分組及實(shí)驗(yàn)方法:

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分組，其中酒精組20只，46%(v/v)按10 g/(kg·d)灌胃，每周連續(xù)灌胃4天，停3天；空白組15只, 相同時(shí)間相同方式灌胃等體積生理鹽水，各組大鼠均自由攝水、攝食。

1.4 動(dòng)物處死和骨組織標(biāo)本獲取

4個(gè)月后各組大鼠均在腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉下處死，立即完整分離雙側(cè)股骨及右側(cè)脛骨近端。逆行剔除軟組織，游離肌肉肌腱，避免刀片等銳器劃傷骨表面(如有損傷則剔除)。在冰浴上，精密切割鋸沿股骨頭下緣完整切下雙股骨頭，并用砂紙將股骨頭斷面磨平。用生理鹽水浸透紗布包裹，放入液氮冷卻后轉(zhuǎn)至-80 ℃中保存，備做骨生物力學(xué)試驗(yàn)。

1.5 股骨干三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)

室溫下，將股骨標(biāo)本緩慢解凍，保持其濕度，放置在力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)支架上(Instron 5569，英斯特朗-美國(guó))，曲面向下，使股骨中點(diǎn)、兩支點(diǎn)中心與加載點(diǎn)重合，勻速加載至標(biāo)本斷裂，描記出載荷-變形(撓度) 曲線(圖2)。測(cè)試溫度23 ℃，試驗(yàn)機(jī)載荷測(cè)量精度0.001 N，位移(撓度) 測(cè)量精度0.001 mm，支座跨距20 mm，壓頭直徑為1.5 mm，加載速度1 mm/min，選用1 000 N以內(nèi)的小載荷量程，用游標(biāo)卡尺測(cè)量斷骨內(nèi)徑和壁厚，精度0.001 mm，記錄并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.6 股骨頭壓縮實(shí)驗(yàn)

將股骨頭下斷面磨平，用游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨頭下緣到軟骨面最遠(yuǎn)處記為股骨頭的高度，并測(cè)量股骨頭直徑。將濕潤(rùn)的股骨頭標(biāo)本置于電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(Instron 5569)上，加載速度為1 mm/min記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制載荷-變形曲線(圖2)，其他測(cè)試條件同股骨干三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)。壓縮試驗(yàn)中為了減少邊界效應(yīng)，在斷面涂潤(rùn)滑劑。

1.7 右側(cè)脛骨近端 HE染色

骨組織標(biāo)本放入4 %多聚甲醛(pH=7.4)中浸泡3 d達(dá)到充分固定, 然后用體積分?jǐn)?shù)為10 %乙二胺四乙酸(EDTA，pH=7.4)，室溫下脫鈣28 d，脫水、石蠟包埋、切片(3 μm厚度)，光鏡下觀察分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

酒精組較空白組骨小梁數(shù)量減少，骨小梁厚度變窄、間隙增大，骨密度降低。見(jiàn)圖1。

圖1 右脛骨HE染色Fig.1 HE staining for the right tibia

圖2 載荷-形變曲線圖Fig.2 Load-deformation curve

圖2為股骨頭壓縮試驗(yàn)和股骨干三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)所記錄的載荷-形變曲線圖，圖中A-B考慮股骨頭軟骨形變?yōu)橹鳎苡坞x股骨頭斷面不平整導(dǎo)致應(yīng)力集中影響較大。B-C考慮股骨頭軟骨下形變?yōu)橹?，曲線呈直線變化，屬?gòu)椥孕巫?。C-D為塑性形變，載荷對(duì)股骨頭產(chǎn)生不可逆損傷。D-E為股骨頭被外力破壞，由于有機(jī)質(zhì)和關(guān)節(jié)軟骨的存在，加之骨小梁間隙尚存，碎裂骨片間位移、相互作用導(dǎo)致應(yīng)力集中-破壞交替現(xiàn)象。E-F為股骨頭被幾乎完全壓扁，骨小梁間隙幾乎完全消失，變化多呈直線趨勢(shì)。G為股骨干屈服點(diǎn)，代表骨抵抗形變的能力；H為最大載荷點(diǎn)，代表骨所能承受極限外力，表征骨抵抗破壞的能力；I為破壞載荷點(diǎn)，有時(shí)與H點(diǎn)重合，是對(duì)骨小梁強(qiáng)度、結(jié)構(gòu)連續(xù)性、皮質(zhì)厚度、橫截面積和材料質(zhì)量的反映。

2.1 大鼠股骨干結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)比較

與空白組相比，酒精灌胃組大鼠股骨干最大載荷、破壞載荷等結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)均不同程度地減少，彈性撓度和最大撓度不同程度地增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，股骨干彈性載荷、破壞撓度及彎曲能量未見(jiàn)顯著變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 股骨干三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)測(cè)試大鼠股骨干結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)Table 1 Three-point bending test to test the structure mechanical parameters of the femoral shaft in

注：與酒精組比較，*P<0.05。

2.2 大鼠股骨干材料力學(xué)參數(shù)比較

與空白組相比，酒精灌胃組大鼠股骨干彈性模量、剛度系數(shù)材料力學(xué)參數(shù)均不同程度地減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；股骨干韌性系數(shù)、彈性應(yīng)變和最大應(yīng)變均不同程度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；其中，彈性應(yīng)力和最大應(yīng)力未見(jiàn)顯著變化(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)測(cè)試大鼠股骨干材料力學(xué)參數(shù)Table 2 Three-point bending test to test the material mechanical parameters of the femoral shaft in

注：與酒精組比較，*P<0.05。

2.3 大鼠股骨頭壓縮試驗(yàn)參數(shù)比較

與空白組相比，酒精灌胃組大鼠股骨頭彈性載荷和最大載荷均不同程度地降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；股骨頭能量吸收及最大形變率彈性應(yīng)力和最大應(yīng)力未見(jiàn)顯著變化(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 股骨頭壓縮試驗(yàn)力學(xué)參數(shù)Table 3 Mechanical parameters of compression test for the femoral

注：最大形變率=最大載荷時(shí)股骨頭被壓形變/股骨頭高度×100%。

2.4 酒精組股骨頭最大載荷與股骨干彈性模量相關(guān)性分析

股骨干彈性模量是股骨重要生物力學(xué)參數(shù)，與骨的幾何形狀無(wú)關(guān)，反映骨內(nèi)在剛度[11]。為分析股骨頭最大載荷與股骨干彈性模量相關(guān)性，行Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)，t=2.6108，P=0.013，說(shuō)明二者有相關(guān)性。由圖2可知，股骨頭最大載荷(Fmax)隨著股骨干彈性模量(modulus，M)增大而呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。進(jìn)一步，行線性回歸分析得，F(xiàn)max=16.261×M+26.509。

圖3 股骨頭最大載荷(Fmax)與股骨干彈性模量(M)的散點(diǎn)圖注：圖中藍(lán)色直線為線性擬合直線，灰色區(qū)域?yàn)閿M合殘差區(qū)域。Fig.3 Scatter plot of maximum femoral head load (Fmax) and femoral shaft elastic modulus (M)

3 討論

關(guān)于酒精攝入對(duì)骨代謝的影響的組織學(xué)研究結(jié)果存在爭(zhēng)議[12]，有證據(jù)表明劑量依賴性影響骨形成和再吸收的不平衡[13]?？傮w而言，酒精誘導(dǎo)的骨重建調(diào)節(jié)的病因是多因素的，可能涉及對(duì)骨代謝直接和間接作用[14]。酒精誘導(dǎo)的骨量丟失的間接作用繼發(fā)于雌二醇(E2)水平的目標(biāo)變化，PTH-維生素D軸的調(diào)節(jié)，生長(zhǎng)刺激的肝胰島素(GH)樣生長(zhǎng)因子1型(IGF-1)和氧化應(yīng)激的影響。骨骼的結(jié)構(gòu)會(huì)隨著酒精攝入而發(fā)生變化，尤其是長(zhǎng)期酗酒者，骨結(jié)構(gòu)改變，力學(xué)性能隨之而變。本研究中，長(zhǎng)期大量灌胃酒精造成大鼠股骨生物學(xué)變化，股骨干的最大載荷、破壞載荷等結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)均不同程度地減少，股骨干彈性模量、剛度系數(shù)材料力學(xué)參數(shù)均不同程度地減少，表明慢性酒精暴露對(duì)骨礦質(zhì)形成有抑制作用，股骨干抵抗破壞性能減弱，骨脆性增加而易斷，這種抑制作用可從股骨干生物力學(xué)變化可見(jiàn)一斑。脛骨近端病理染色亦驗(yàn)證了長(zhǎng)期酒精攝入對(duì)骨代謝的影響(圖1)，體現(xiàn)了骨形態(tài)和功能的相關(guān)性[15]。股骨干韌性系數(shù)、彈性應(yīng)變和最大應(yīng)變均不同程度升高，彈性撓度和最大撓度不同程度地增加，提示股骨干有機(jī)質(zhì)相對(duì)增多，該變化考慮無(wú)機(jī)質(zhì)丟失過(guò)多所致。

可簡(jiǎn)單地將骨骼分為密質(zhì)骨和松質(zhì)骨[16]，骨骼是由多種材料(有機(jī)質(zhì)、無(wú)機(jī)質(zhì))構(gòu)成的復(fù)合體，呈非均勻分布的特點(diǎn)。股骨的形狀較其他骨的形狀更加接進(jìn)空心圓筒,其應(yīng)力分析可用空心圓筒近似，而其他骨的形狀較復(fù)雜，分析的結(jié)果誤差較大。最大荷載直接反映松質(zhì)骨的骨小梁的骨質(zhì)、結(jié)構(gòu)的連續(xù)性、皮質(zhì)骨的強(qiáng)度、骨的橫截面積的大小等，是對(duì)骨質(zhì)量的綜合反映，可直接從荷載-變形曲線(圖2)上讀取，本研究中股骨干和股骨頭最大荷載均降低，提示酒精導(dǎo)致骨耐外力性能降低。結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)主要反映出骨的結(jié)構(gòu)特征的變化，它主要受到骨重建過(guò)程中骨的幾何形狀、體積、密度分布的變化的影響，當(dāng)然，骨的強(qiáng)度、彈性模量等材料力學(xué)指標(biāo)的變化對(duì)它也有一定影響。骨的成分與生物力學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系變化是復(fù)雜的，需采用多方面的因素來(lái)衡量，總體而言，骨礦含量的變化對(duì)彈性區(qū)的影響較大，而有機(jī)質(zhì)的變化對(duì)塑性區(qū)的變化影響較大。酒精抑制骨形成[17]，增加破骨細(xì)胞活性，使骨礦量減少，有機(jī)質(zhì)相對(duì)增加，表現(xiàn)出股骨干彈性模量和剛度降低，股骨干韌性系數(shù)、彈性應(yīng)變和最大應(yīng)變均不同程度升高，關(guān)于酒精引起股骨干生物力學(xué)變化的詳細(xì)分子及細(xì)胞機(jī)制需進(jìn)一步研究。本研究采用游離股骨頭進(jìn)行壓縮測(cè)試，消除了股骨頸和股骨干形變的影響。分析了酒精導(dǎo)致股骨頭生物力學(xué)的變化，由于股骨頭并非密度均勻、形態(tài)規(guī)則、組織單一的球體，除了堅(jiān)硬的骨組織，表面覆蓋較軟的關(guān)節(jié)軟骨，因此游離股骨頭壓縮實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出載荷先隨形變緩慢上升，至軟骨完全壓平后，由于軟骨下骨組織彈性形變表現(xiàn)出直線上升，變形至屈服點(diǎn)后，發(fā)生塑性形變，隨后出現(xiàn)最大載荷，終止股骨頭完全破壞。結(jié)果表明酒精可引起大鼠股骨頭最大載荷減低，減弱股骨頭抵抗外力性能，提示酒精導(dǎo)致股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步分析表明，骨頭最大載荷與股骨干彈性模量具有相關(guān)性，提示可從股骨干生物力學(xué)性能來(lái)粗略地評(píng)估酒精對(duì)股骨頭的影響，為股骨頭壞死的防治及療效評(píng)估提供一種參考[18]。

本研究測(cè)試結(jié)果表明，長(zhǎng)期酒精攝入導(dǎo)致大鼠股骨干剛性降低，骨頭最大載荷與股骨干彈性模量具有相關(guān)性，提示可從股骨干生物力學(xué)性能來(lái)粗略地評(píng)估酒精對(duì)股骨頭的影響；長(zhǎng)期酒精攝入導(dǎo)致大鼠股骨干韌性相對(duì)增高，股骨干和股骨頭抵抗外力性能降低，易發(fā)脆斷，推測(cè)酒精導(dǎo)致骨組織礦質(zhì)和有機(jī)質(zhì)成分變化，提示長(zhǎng)期酒精攝入對(duì)骨組織的不良反應(yīng)。