黃 優(yōu)，陳海云，何超明，龐明武，顏 博，王 景，李華堅(jiān)，高唯一

0 引言

腦梗死是最常見(jiàn)的缺血性腦血管疾病，頸動(dòng)脈狹窄是缺血性腦血管病的重要危險(xiǎn)因素，流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，頸動(dòng)脈狹窄是進(jìn)行性腦梗死的重要危險(xiǎn)因素[1]，其同側(cè)腦梗死的發(fā)病率可以達(dá)到90%以上。丁苯酞(Butyphthalide)是從芹菜籽中提取的天然產(chǎn)物，可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能[2]，次級(jí)線粒體源性Caspase激活因子(Smac，又稱低等電點(diǎn)的IAP直接結(jié)合蛋白)是決定腦缺血后腦細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白[3]。本研究構(gòu)建頸動(dòng)脈狹窄大鼠模型，在此基礎(chǔ)上探討丁苯酞對(duì)模型大鼠腦組織缺血再灌注后Smac蛋白的影響以及神經(jīng)保護(hù)作用，為丁苯酞的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器 SPF級(jí)健康雄性SD 大鼠，8周齡，體重260～310 g，購(gòu)自海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(瓊)2018-0004。丁苯酞膠囊購(gòu)自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司(批號(hào)：20180216)，Smac和β-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司，HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉生物科技股份有限公司，Bradford蛋白定量試劑盒和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)有限公司，顯微鏡和HPIAS-1000圖像分析系統(tǒng)為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品，電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 大鼠動(dòng)物模型的建立 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后建模，隨機(jī)分為假手術(shù)組(15只)和頸動(dòng)脈狹窄模型組(60只)，參照鄭文婧等[4]的方法，造模簡(jiǎn)述如下：10%水合氯醛1 ml腹腔注射，大鼠麻醉后沿頸部正中切開(kāi)，分離右頸總動(dòng)脈后平行放置5 ml注射器針頭，6-0號(hào)尼龍線扎緊針頭和頸總動(dòng)脈，抽出針頭，見(jiàn)血流恢復(fù)后間斷縫合肌肉和皮膚，假手術(shù)組只分離右頸總動(dòng)脈，不做尼龍線結(jié)扎，術(shù)后注射青霉素鈉防止感染。喂養(yǎng)6周后，血管超聲顯示，手術(shù)側(cè)右頸總動(dòng)脈峰值血流速度155～170 cm/s、舒張末血流速度60～100 cm/s為頸動(dòng)脈狹窄造模成功。隨后參照Han等[5]的方法，使用頸動(dòng)脈狹窄模型大鼠構(gòu)建大腦中動(dòng)脈缺血(MCAO)模型。頸動(dòng)脈狹窄模型大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量丁苯酞(20 mg/kg)組、中劑量丁苯酞(40 mg/kg)組和高劑量丁苯酞(80 mg/kg)組，每組15只。丁苯酞組在建模前3 d，每天給予20、40、80 mg/kg丁苯酞灌胃，對(duì)照組和丁苯酞組水合氯醛麻醉后，分離狹窄側(cè)右頸總動(dòng)脈，插入尖端涂有硅橡膠的尼龍單絲縫合線，進(jìn)入約2 cm達(dá)大腦中動(dòng)脈處，阻塞1.5 h后取出縫線恢復(fù)血供，縫合皮膚，術(shù)后注射青霉素鈉防止感染。假手術(shù)組僅分離血管，不插入尼龍線。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)分[5]MCAO造模后24 h使用平衡木實(shí)驗(yàn)(Beam balance test，BBT)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，把小鼠置于1.5 cm的平板上，站穩(wěn)無(wú)搖晃持續(xù)2 min記1分，站穩(wěn)有搖晃但可以持續(xù)2 min記2分，滑至一側(cè)但2 min內(nèi)未掉下記3分，2 min內(nèi)掉下記4分，數(shù)秒內(nèi)掉下記5分，無(wú)法站立記6分。

1.4 HE、TUNEL染色 各組SD大鼠造模24 h后，麻醉斷頭取缺血腦組織固定于4%甲醛，24 h后包埋于石蠟中，切成5 μm冠狀切片。常規(guī)HE染色顯微鏡下觀察神經(jīng)元細(xì)胞變化，TUNEL染色嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞為神經(jīng)元胞體萎縮，深褐染細(xì)胞，是凋亡細(xì)胞。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)缺血半暗帶區(qū)的高倍視野(200×)，計(jì)算每個(gè)樣品的凋亡指數(shù)(Apoptotic index，AI)=陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

1.5 Smac蛋白的Western blot檢測(cè) 各組SD大鼠造模24 h后，麻醉斷頭取缺血腦組織100 mg加入蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后，取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜，然后加入Smac (1∶1 000)或β-actin一抗(1∶5 000)，4 ℃過(guò)夜后加入二抗(1∶5 000) 2 h，化學(xué)發(fā)光法掃描條帶，用Bandscan5.0軟件計(jì)算Smac的相對(duì)灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，多組均數(shù)間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁苯酞對(duì)模型SD大鼠神經(jīng)功能的影響 假手術(shù)組、對(duì)照組、低劑量丁苯酞組、中劑量丁苯酞組和高劑量丁苯酞組SD大鼠BBT評(píng)分分別為1.07±0.12、5.64±1.06、4.84±0.82、4.13±0.65、3.76±0.52，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.71，P<0.05)。

2.2 丁苯酞對(duì)模型SD大鼠缺血區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)以及凋亡的影響 HE染色顯示，正常神經(jīng)元細(xì)胞染色清晰，胞漿豐富，核居中，核仁清晰，排列整齊，見(jiàn)圖1細(xì)黑箭頭所指；缺血再灌注模型組見(jiàn)神經(jīng)元丟失，退行性變，神經(jīng)元細(xì)胞收縮、核固縮、細(xì)胞間隙增大，見(jiàn)圖1粗黑箭頭所指。給予丁苯酞干預(yù)后，這種損傷神經(jīng)元顯著減少。經(jīng)TUNEL染色后顯示，假手術(shù)組、對(duì)照組、低劑量丁苯酞組、中劑量丁苯酞組和高劑量丁苯酞組SD凋亡指數(shù)分別為0.00±0.00、0.75±0.18、0.62±0.14、0.47±0.10、0.32±0.07，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.684，P<0.05)。凋亡細(xì)胞見(jiàn)圖2中黑箭頭所指。

2.3 丁苯酞對(duì)模型SD大鼠缺血區(qū)Smac蛋白表達(dá)的影響 從圖3可見(jiàn)，缺血再灌注模型大鼠Smac蛋白表達(dá)升高，給予丁苯酞干預(yù)后，缺血再灌注導(dǎo)致的Smac蛋白升高得到了抑制。經(jīng)灰度掃描，假手術(shù)組、對(duì)照組、低劑量丁苯酞組、中劑量丁苯酞組和高劑量丁苯酞組Smac蛋白的相對(duì)灰度值分別為0.076±0.012、0.852±0.143、0.705±0.127、0.382±0.073、0.115±0.024，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.71，P<0.05)。

圖1 缺血區(qū)腦組織的HE染色(200×)

圖2 缺血區(qū)腦組織的TUNEL染色(200×)

圖3 Smac蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)

注：A.假手術(shù)組,B.對(duì)照組,C.低劑量丁苯酞組,D.中劑量丁苯酞組,E.高劑量丁苯酞組.

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，60%左右的腦梗死患者存在頸動(dòng)脈狹窄，快速恢復(fù)血供是腦梗死患者臨床治療的關(guān)鍵[6]，但恢復(fù)血供再灌注后，有時(shí)腦組織的損傷更加嚴(yán)重，缺血再灌注損傷成為影響腦梗死患者臨床療效的重要因素[7]。丁苯酞是我國(guó)自主研發(fā)的藥物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床治療研究均顯示了其可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能[8-9]，而且對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄患者也可以發(fā)揮治療作用[10]。本研究結(jié)果顯示，模型組神經(jīng)功能受損，鏡下神經(jīng)元退行性變，說(shuō)明造模成功，提前給予丁苯酞干預(yù)后神經(jīng)功能評(píng)分顯著減低，呈劑量依賴性，鏡下退行性變的神經(jīng)元減少。袁齊宏等[11]采用大鼠腦中動(dòng)脈栓塞模型，發(fā)現(xiàn)丁苯酞可以對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能起到保護(hù)作用，但未對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入探討。

凋亡通路是神經(jīng)元細(xì)胞死亡的一條主要通路，Smac蛋白含有184個(gè)氨基酸，是凋亡通路中的重要蛋白，Smac蛋白表達(dá)升高后可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合XIAP、Apaf-1凋亡復(fù)合體，解除凋亡復(fù)合體對(duì)Caspase-9和Caspase-3的抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。在缺血再灌注腦組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了致凋亡蛋白Smac的表達(dá)顯著增高。李國(guó)前等[13]研究顯示，抑制Smac信號(hào)通路可以顯著減少腦缺血再灌注模型大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注模型組大鼠腦組織Smac蛋白顯著升高，丁苯酞可以劑量依賴性地緩解缺血再灌注模型組大鼠腦組織Smac蛋白的升高。本研究也發(fā)現(xiàn)了缺血再灌注模型組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡顯著增加，而丁苯酞可以劑量依賴性地減低缺血再灌注模型組大鼠神經(jīng)元的凋亡，提示丁苯酞下調(diào)Smac蛋白表達(dá)，可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的主要機(jī)制。

綜上所述，本研究顯示，丁苯酞可以顯著減低Smac蛋白表達(dá)，抑制頸動(dòng)脈狹窄大鼠缺血再灌注損傷誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用。