張曉蘭，江翊國(guó)，沈 黎，張學(xué)會(huì)，潘 晨，趙 萍*

0 引言

七葉皂苷是從七葉樹科植物天師栗的干燥成熟種子中提取的一種含酯鍵的三萜皂苷，主要通過(guò)刺激前列腺素的釋放，導(dǎo)致血管收縮，降低血管壁對(duì)低分子蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)的滲透。在國(guó)外，七葉皂苷口服制劑作為非處方藥，被廣泛應(yīng)用于治療各種慢性靜脈功能障礙[1]。在我國(guó)，七葉皂苷注射液通常用于治療腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致腫脹，也用于靜脈回流障礙性疾病[2]。最新的臨床研究表明，七葉皂苷在腦出血的治療中也具有明顯療效[3]。隨著其臨床應(yīng)用日益廣泛，不良反應(yīng)報(bào)道也越來(lái)越多，主要不良反應(yīng)為靜脈炎，表現(xiàn)為靜脈穿刺部位有紅腫、疼痛感或條索感[4-6]。但目前對(duì)于七葉皂苷與靜脈炎的具體代謝關(guān)系尚無(wú)深入研究。

代謝組學(xué)(Metabonomics)是研究生物在多種因素作用下(疾病、藥物、遺傳、變異、環(huán)境)，內(nèi)源性小分子代謝物的變化。相比于液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)，核磁共振(NMR)法因?yàn)楦咝?、破壞性小、結(jié)構(gòu)信息豐富等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)領(lǐng)域研究[7-8]。本文采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究七葉皂苷導(dǎo)致靜脈炎患者與未發(fā)生靜脈炎患者血液中代謝產(chǎn)物的差異，旨在發(fā)現(xiàn)容易發(fā)生靜脈炎的潛在生物標(biāo)志物和可能發(fā)生變化的代謝通路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2017年12月至2018年10月在江蘇省人民醫(yī)院盛澤分院因骨折入院的患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①入院后使用注射用七葉皂苷鈉的患者。②患者住院前未服用其他藥物，無(wú)基礎(chǔ)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、腦、肝、腎等重要器官嚴(yán)重功能障礙或不全的患者。用藥期間根據(jù)患者發(fā)生靜脈炎的情況分為發(fā)生靜脈炎組和未發(fā)生靜脈炎組。發(fā)生靜脈炎組9例，男3例，女6例，年齡(50±21)歲。未發(fā)生靜脈炎組11例，男5例，女6例，年齡(57±19)歲。兩組患者年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者入院后除了七葉皂苷注射液，同時(shí)給予常規(guī)的手術(shù)、康復(fù)或止痛處理。

1.2 血樣采集及前處理 患者入院后立即抽取靜脈血約0.5 ml，4 ℃冷凍離心(4 000 r/min，5 min)，得到血清，置于-80 ℃冰箱中保存。檢測(cè)前將血清樣本置于冰水混合物中解凍，取血清250 μl加入到1.5 ml EP管中，加入750 μl的甲醇溶液沉淀蛋白，混勻，靜置，4 ℃冷凍離心(10 000 r/min，10 min)，取上清，吸取450 μl至1.5 ml的離心管中，加入50 μl TSP重水，放入渦旋儀上震蕩后混勻，4 ℃冷凍離心(12 000 r/min，10 min)，上清液裝入5 mm核磁管中，進(jìn)行檢測(cè)。

1.31H-NMR分析條件 使用Bruker AvanceⅢ500 MHz核磁共振譜儀采集樣本數(shù)據(jù)。采用弛豫編輯Carr-Purcell-Mei boom-Gill (CPMG)脈沖序列進(jìn)行測(cè)試，參數(shù)為：自旋弛豫延遲為320 ms、自由感應(yīng)衰減為32 K數(shù)據(jù)點(diǎn)、譜寬10 000 Hz，掃描128次。所有實(shí)驗(yàn)均在5 mm的探頭中進(jìn)行，測(cè)試溫度維持在298 K。

1.4 數(shù)據(jù)處理 入組患者的性別、年齡差異采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)判斷差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用Topspin 2.1軟件，將TSP作為化學(xué)位移的參考峰，定為0 δ。采用Mest Re Nova 9.0軟件得到1H-NMR圖譜，去除4.3～5.5 ppm區(qū)域殘余水峰的影響。0.5～8.5 ppm區(qū)域內(nèi)以0.015 為單位進(jìn)行分段積分，所得積分值按每張圖譜的總積分面積進(jìn)行歸一化處理。數(shù)據(jù)采用均值中心化預(yù)處理后先進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis，PCA)，主成分分析是對(duì)所有樣本的總體分布趨勢(shì)分析，初步判斷各組間的分離程度、自然聚集狀態(tài)及是否存在奇異樣本，找出并剔除異常離散樣本點(diǎn)，以保障數(shù)據(jù)分析的有效性。再通過(guò)采用正交矯正信號(hào)和監(jiān)督性多維統(tǒng)計(jì)分析方法結(jié)合放大組間差異的正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA)和最大限度地通過(guò)排除不相關(guān)因素來(lái)區(qū)別各組分的正交信號(hào)校正偏最小二乘法判別分析法(Orthogonal signal correction partial least-squares discriminant analysis，OSC-PLS-DA)獲得重要影響值。彩色荷載圖(Loading Plot)用于尋找對(duì)組別分離有貢獻(xiàn)的差異性代謝物，峰的顏色越紅，代表這種代謝物在兩組中的含量差異越顯著，越藍(lán)則表明差異越小。

2 結(jié)果

2.1 主成分分析 從圖1可見，發(fā)生靜脈炎組和未發(fā)生靜脈炎組患者的代謝物存在重疊，未完全分開。

圖1 發(fā)生靜脈炎組和未發(fā)生靜脈炎組PCA結(jié)果

2.2 正交偏最小二乘法判別分析 從圖2可見，發(fā)生靜脈炎的組分和未發(fā)生靜脈炎的組分不重合的部分較多，表明存在大分子代謝物的差異。s-plot圖中，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)，越具有討論的意義，越可能是差異代謝物，從圖中可知，共標(biāo)記出肌醇、磷酸肌酸、甲醇、葡萄糖、癸二酸鹽等10種代謝物。

圖2 發(fā)生靜脈炎組和未發(fā)生靜脈炎組OPLS-DA結(jié)果

2.3 正交信號(hào)校正偏最小二乘法判別分析法 從圖3可見，兩組雖然沒(méi)有完全分開，但是重合的部分很少。s-plot圖中，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)，越具有討論的意義，越可能是差異代謝物，共標(biāo)記出亮氨酸、賴氨酸、甲醇、葡萄糖等11種代謝物。

圖3 發(fā)生靜脈炎組和未發(fā)生靜脈炎組OSC-PLS-DA結(jié)果

2.4 彩色載荷圖 通過(guò)彩色載荷圖(圖4)獲得發(fā)生靜脈炎組和未發(fā)生靜脈炎組的候選特征峰。

2.5 與發(fā)生靜脈炎相關(guān)的血清特征代謝物組的篩選 最終篩選得到 6 種具有顯著差異的化合物，這些生物標(biāo)志物的變化趨勢(shì)結(jié)果見表1。

圖4 發(fā)生靜脈炎組和未發(fā)生靜脈炎組VIP荷載

3 討論

本文采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究七葉皂苷導(dǎo)致的靜脈炎患者與未發(fā)生靜脈炎患者血清代謝產(chǎn)物的差異，旨在發(fā)現(xiàn)容易發(fā)生靜脈炎的潛在生物標(biāo)志物。與未發(fā)生靜脈炎的患者相比，容易發(fā)生靜脈炎的患者血清中肌醇、甲醇含量明顯增高，但亮氨酸、賴氨酸、磷酸肌酸、苯基丙氨酸含量明顯下降。將這6種代謝物通過(guò)Metaboanalyst數(shù)據(jù)庫(kù)[9]進(jìn)行代謝通路分析。影響值大于0.1的通路見圖5，共有2條代謝通路，分別為賴氨酸降解和苯丙氨酸代謝。賴氨酸和苯基丙氨酸為必需氨基酸，在分解代謝過(guò)程中轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A參與三羧酸循環(huán)。容易發(fā)生靜脈炎的患者體內(nèi)的必需氨基酸含量下降，表明這部分患者存在氨基酸代謝紊亂。

表1 與七葉皂苷導(dǎo)致的靜脈炎相關(guān)的血清代謝物

圖5 代謝產(chǎn)物代謝通路富集分析

綜上所述，本研究從代謝組學(xué)和代謝通路這2個(gè)方面研究七葉皂苷導(dǎo)致靜脈炎患者與未發(fā)生靜脈炎患者血液中代謝物與代謝通路的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)容易發(fā)生靜脈炎的患者存在氨基酸代謝紊亂。核磁共振代謝組學(xué)由于具有簡(jiǎn)單、快速和重現(xiàn)性好的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在評(píng)價(jià)藥物療效和毒理學(xué)研究方面具有巨大的潛力[10-11]，但本研究由于樣本量有限，對(duì)于七葉皂苷致靜脈炎的發(fā)生機(jī)制的代謝組學(xué)研究還需要更大范圍和前瞻性的試驗(yàn)驗(yàn)證。