王 超，陳 尚，閆立凱，王衛(wèi)東，周厚民，劉 璞，周少飛*

0 引言

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)，在世界癌癥中其死亡率位居第4位，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1-2]。目前結(jié)腸癌主要采用手術(shù)切除治療，患者術(shù)后易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，需要給予放化療、中草藥物治療和分子靶向等輔助性治療。中草藥在減少腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和減輕患者術(shù)后不良反應(yīng)等方面有著至關(guān)重要的作用。因此，研發(fā)不良反應(yīng)低且高效的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種非黃酮類多酚的天然藥物，存在于多種天然植物中，其中以葡萄皮中的含量最高[3]。研究表明，Res具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和毒性小的特點(diǎn)，在抗炎癥、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性方面具有一定的調(diào)節(jié)作用[4]。在肝癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤中，Res對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有著明顯的抑制作用[5-6]。研究表明，不同濃度Res可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性[7]。但是有關(guān)Res對(duì)結(jié)腸癌侵襲的作用機(jī)制尚不清楚，本研究采用不同濃度的Res干預(yù)結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞，觀察細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，并初步探討其可能的機(jī)制，為進(jìn)一步的臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液和qRT-PCR引物(美國(guó)Invitrogen公司)，RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，抗體E-cadherin、Vimentin和N-cadherin(美國(guó)CST公司)，二抗、內(nèi)參(GAPDH)、MTT試劑盒和蘇木素(上海碧云天公司)，二甲基亞砜(DMSO)和Matrigel(北京索萊寶科技公司)，胰酶、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，白藜蘆醇(美國(guó)Sigma公司)，DMSO溶解白藜蘆醇，濃度的配制采用無血清的DMEM。酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，qRT-PCR儀器(中國(guó)香港Gene Company Limited公司)，高分辨率相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞采用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞孵箱中胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 篩選Res對(duì)HCT-8細(xì)胞增殖活性影響的最佳濃度和時(shí)間 采用MTT法。首先調(diào)整細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后將細(xì)胞消化制備成單細(xì)胞懸液(密度調(diào)整為3×104/ml)，取100 μl細(xì)胞懸液均勻接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在孔板邊緣加入等量的PBS，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行細(xì)胞同步化。按照白藜蘆醇說明書進(jìn)行配制，將不同濃度的白藜蘆醇(終濃度分別為0、40、80、120 μmol/L)加入各孔中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10 μl的MTT溶液(5 g/L)繼續(xù)置于培養(yǎng)基中4～5 h。去除孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，加入100 μl的DMSO溶液(終濃度<0.1%)，搖勻后振蕩反應(yīng)10～15 min。將96孔板放入酶標(biāo)儀中，于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔細(xì)胞的吸光度值(即OD值)。OD值代表細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果取6孔的平均值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次；根據(jù)結(jié)果篩選出最佳的濃度和時(shí)間。

1.2.3 Res對(duì)HCT-8細(xì)胞同種黏附能力的影響 取加藥處理且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，胰酶消化制備成細(xì)胞懸液(3.5×104/ml)，取1 ml細(xì)胞懸液均勻接種于24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。PBS沖洗3次，取1 ml 0.02%胰酶加入到各孔中，于水平搖床上搖晃10 min和20 min；收集脫落的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，其余孔內(nèi)的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)。細(xì)胞分離率=脫落細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 Res對(duì)HCT-8細(xì)胞異種黏附能力的影響 首先取100 μl纖維蛋白黏連蛋白(5 μg/ml)平鋪于96孔板中，室溫放置4 h后，采用2%BSA封閉1 h，于4 ℃冰箱中保持備用。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K1細(xì)胞懸液(密度為4×104/ml)100 μl均勻接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。棄培養(yǎng)基，將10 μl MTT溶液加入各孔中繼續(xù)反應(yīng)4 h。棄除液體，將100 μl的DMSO加入孔中震蕩反應(yīng)15 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)并計(jì)算其OD值。細(xì)胞黏附率=處理組的OD值/空白對(duì)照組的OD值×100%。

1.2.5 Res對(duì)HCT-8細(xì)胞遷移能力的影響 采用Transwell小室試驗(yàn)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將不同濃度的RES與HCT-8細(xì)胞共同培養(yǎng)，用胰酶消化制備成密度為5×105/ml細(xì)胞懸液，取200 μl細(xì)胞懸液均勻接種24孔Transwell小室的上室，在下室中加入600～700 μl培養(yǎng)基(10%FBS的DMEM培養(yǎng)基)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。清潔上室，采用4%多聚甲醛固定下室膜表面穿透的細(xì)胞至少50 min以上。蘇木素染色各組細(xì)胞，在倒置顯微鏡下(100×)隨機(jī)選取5個(gè)視野并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Res對(duì)HCT-8細(xì)胞侵襲能力的影響 采用Transwell小室試驗(yàn)。首先按照Matrigel基質(zhì)膠說明書將Matrigel膠與無血清的DMEM培養(yǎng)基(比例1∶3)混合均勻，取40 μl混合液均勻加入到小室膜的上表面，在紫外線燈下照射4 h以上備用。按照細(xì)胞遷移試驗(yàn)進(jìn)行剩余步驟，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，穿膜的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力的變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Res對(duì)HCT-8細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA的影響 采用qRT-PCR方法。RES干預(yù)HCT-8細(xì)胞后，按trizol法操作提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物E-cadherin：上游引物5′-AGGCTTCCCTCTTTCAT CTCA-3′，下游引物5′-CCATAGTTCCGCTCTGTCTTTGG-3′；引物N-cadherin：上游引物5′-ATTGAAGGTTTGCCAGTGTGC-3′，下游引物5′-TATGGCGTTCTTTATCCGA-3′；引物Vimentin：上游引物5′-GCAATGTTAAGATGGCCCTCA-3′，下游引物5′-ATAGTGGGTATCAACCAGACC-3′；內(nèi)參引物GAPDH：上游引物5′-AGTGGAAGATGGTGATGGGAGT-3′，下游引物5′-CGTGAAGGTCGGAGTCAACCT-3′。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 15 s，變性95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，利用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.8 Res對(duì)HCT-8細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的影響 采用蛋白免疫印跡法。首先提取細(xì)胞總蛋白，然后BCA法蛋白定量后變性，與蛋白上樣緩沖等比例混合，放置-80 ℃保存。按照說明書配制濃縮膠和分離膠，放置30 min，每孔30 μg蛋白上樣量，90 V恒壓下電泳，完成后轉(zhuǎn)膜(90 V，60～120 min)。封閉1 h，加入一抗，于4 ℃冰箱過夜。次日取出PVDF膜洗凈后，加入二抗，37 ℃恒溫下孵育1 h。再次洗膜，熒光顯色并拍照。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析并計(jì)算各組蛋白條帶的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 Res對(duì)HCT-8細(xì)胞增殖活性的影響 Res(0、40、80、120 μmol/L)分別處理HCT-8細(xì)胞24、48、72 h后，MTT結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，隨著Res濃度的提高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖活性的抑制能力增強(qiáng)(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比，Res 120 μmol/L在48 h可以明顯抑制細(xì)胞的增殖活性(P<0.05)。因此，選擇Res 120 μmol/L為最佳濃度用于后續(xù)細(xì)胞部分實(shí)驗(yàn)。

表1 各組HCT-8細(xì)胞的OD值

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05

2.2 Res對(duì)HCT-8細(xì)胞黏附能力的影響 細(xì)胞分離試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞處理10 min和20 min時(shí)，隨著Res濃度的升高，在不同的時(shí)間段，細(xì)胞的分離率逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。異種細(xì)胞的黏附試驗(yàn)顯示，RES干擾HCT-8細(xì)胞48 h后，隨著濃度的增加，細(xì)胞的異種黏附能力受到抑制，且具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 Res對(duì)HCT-8細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 HCT-8細(xì)胞遷移試驗(yàn)如圖1所示，空白對(duì)照組和Res 120 μmol/L穿膜的細(xì)胞數(shù)分別為：129.39±5.68和76.46±6.35，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞的侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組和Res 120 μmol/L穿膜的細(xì)胞數(shù)分別為：98.52±6.62和65.36±5.53，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明Res 120 μmol/L可以明顯抑制HCT-8細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

表2 細(xì)胞黏附能力的變化(n=3，%)

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05

圖1 Res對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

2.4 Res對(duì)細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)的影響 Res 120 μmol/L干預(yù)細(xì)胞后提取mRNA，qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，Res 120 μmol/L可以上調(diào)細(xì)胞中E-cadherin mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)，抑制細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(P<0.05)；表明Res可以通過逆轉(zhuǎn)EMT來抑制細(xì)胞的侵襲遷移能力。見圖2。

圖2 Res對(duì)細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)的影響(n=3)

2.5 Res對(duì)細(xì)胞中AKT、P-AKT、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的影響 Res 120 μmol/L干預(yù)細(xì)胞48 h，蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，Res 120 μmol/L可上調(diào)細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)(P<0.05)，抑制細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin蛋白的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。見圖3。

圖3 Res對(duì)細(xì)胞中P-AKT、AKT、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響(n=3)

3 討論

Res(分子式為C14H12O3)是許多植物中常見的多酚類天然化合物，最早在葡萄皮中發(fā)現(xiàn)該種物質(zhì)，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)該種化合物廣泛存在于藜蘆、花生、桑樹等多種植物中[8]。研究表明，Res可以通過多種細(xì)胞信號(hào)通路阻斷腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而達(dá)到一定的抗癌能力。在前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中，Res通過多種不同的形式參與腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)生和發(fā)展的過程，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖活性和浸潤(rùn)能力具有明顯的抑制作用[9]。

在消化道腫瘤中，結(jié)腸癌的發(fā)病率僅次于肝癌和胃癌[10]，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，是由多種因素(例如飲食習(xí)慣和基因)突變共同造成的結(jié)果[11]。中草藥在結(jié)腸癌的輔助治療中發(fā)揮重要作用。研究表明，在結(jié)腸癌的治療中，Res可能通過改變PTEN的表達(dá)水平從而抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖活性[12]。本研究前期通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著Res濃度的提高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)HCT-8細(xì)胞的增殖活性的抑制能力逐漸增強(qiáng)，與Res可以抑制人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力的研究結(jié)果相一致[7]。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是上皮細(xì)胞失去極性向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變的過程，從而使腫瘤細(xì)胞獲得向周圍組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力，EMT在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義[13-14]。侵襲和轉(zhuǎn)移能力在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要作用。EMT作為一種驅(qū)動(dòng)力，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生極性和黏附性的改變，并且促進(jìn)腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[15-16]。研究表明，在胰腺癌中，Res可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生從而抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[17]。在結(jié)腸癌中，PAK1通過AKT依賴性途徑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Res可以增加同種細(xì)胞的黏附能力和降低異種細(xì)胞的黏附力。在前期篩選出有效的Res 120 μmol/L濃度后，Res 120 μmol/L與結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞共同培養(yǎng)結(jié)果顯示，Res 120 μmol/L可以有效地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。該結(jié)果與卵巢癌中Res可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的結(jié)果一致[19]。進(jìn)一步蛋白免疫印跡法和qRT-PCR結(jié)果表明，Res 120 μmol/L可以使PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵因子P-AKT蛋白降低，EMT上皮細(xì)胞標(biāo)志性E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)升高，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)水平下調(diào)，而AKT蛋白無明顯變化，這與在胃癌中Res可以有效地阻斷腫瘤細(xì)胞EMT的結(jié)果一致[20]。

總之，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了不同濃度Res對(duì)人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞的增殖活性和黏附均有抑制作用，Res通過逆轉(zhuǎn)EMT抑制人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其作用機(jī)制可能受PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控，這為Res在結(jié)腸癌的臨床用藥研究提供理論依據(jù)。