張立川，李井野*，張 睿，王曉煜，石 剛

0 引言

結(jié)直腸惡性腫瘤在發(fā)展中國家的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，隨著化療及靶向治療的發(fā)展，無病生存率及總生存率近年略有升高，但1/3結(jié)直腸惡性腫瘤初診時即為晚期。化療及靶向治療仍然是晚期結(jié)直腸癌延長生存期綜合治療的主要方式。化療及靶向治療耐藥是導(dǎo)致治療終止及影響化療效果的首要因素。對于化療耐藥及化療敏感性增效的研究是目前結(jié)直腸惡性腫瘤的主要方向。微小RNA(miRNA)及其上下游通路蛋白在腫瘤耐藥中具有重要的作用。5-FU是結(jié)直腸癌一線化療的主導(dǎo)藥物，5-FU的應(yīng)用顯著延長了晚期結(jié)直腸癌生存期，耐藥是影響其治療效果的重要原因。有研究顯示，分泌型卷曲相關(guān)蛋白4(SFRP4，Secreted Frizzled-Related Protein 4)在消化系統(tǒng)惡性腫瘤(如胰腺癌及腸癌組織)中表達(dá)水平低于正常組織，與腫瘤的惡性行為呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，為抑癌基因[1-3]。另有研究顯示，miR-346在肝癌及結(jié)直腸癌等惡性腫瘤組織中表達(dá)高于正常組織，為促癌基因[4-6]。本課題組前期研究顯示，miR-346與SFRP4在結(jié)直腸癌細(xì)胞及組織中表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測，二者存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系[7-8]。二者是否在結(jié)腸癌5-FU耐藥中具有調(diào)控作用，需進(jìn)一步實驗證明。本研究目的在于觀察miR-346及SFRP4在結(jié)腸癌5-FU誘導(dǎo)毒性中的作用，并進(jìn)一步觀察二者的調(diào)控關(guān)系，為結(jié)腸癌5-FU化療增敏及耐藥逆轉(zhuǎn)提供靶向候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料 人SW480及HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞購自ATCC(American Type Culture Collection，Manassas，VA，美國)。細(xì)胞在含有10%胎牛血清(美國Invitrogen公司)和1%青霉素/鏈霉素(美國Invitrogen公司)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(美國Invitrogen公司)中培養(yǎng)。上調(diào)SFRP4表達(dá)的pcDNA3.1-SFRP4、NC(陰性對照，Negative control)、陰性對照miRNA(Con-miR)、空載體(Vector)及引物由Biomics生物技術(shù)有限公司(中國南通)設(shè)計合成。miR-346 mimics及miR-346 inhibitor購自Cell Signaling公司(美國)。Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)。蛋白酶抑制劑PMSF購自Sigma公司(美國)。凋亡檢測試劑盒及MTT試劑盒購自Sigma公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染步驟 將SW480及HT-29細(xì)胞接種到24孔板中并孵育過夜。根據(jù)說明書，將pcDNA3.1-SFRP4、NC、Con-miR、miR-346、miR-346+Vector、miR-346+SFRP4等分別使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染SW480和HT-29細(xì)胞。

1.2.2 Western blot法 以具有蛋白酶抑制劑PMSF的冷RIPA緩沖液提取SW480及HT-29細(xì)胞的總蛋白。通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)裂解物，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜用5%脫脂奶粉在PBST中封閉2 h，然后在4 ℃下一抗孵育過夜，TBST洗膜3次后加二抗，在室溫下孵育1 h，給予化學(xué)發(fā)光，采用QuantityOne計量灰度值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.3 細(xì)胞活力測定 采用MTT法評估細(xì)胞活力。將SW480及HT-29細(xì)胞細(xì)胞以1×104個細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板培養(yǎng)基中孵育過夜。然后，用指定濃度的(400、800、1 200、1 600、2 000 μg/ml)5-FU處理細(xì)胞。在37 ℃孵育48 h后，向每個孔中加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，再孵育4 h。除去上清液后，加入150 μl二甲基亞砜。通過酶標(biāo)儀測量波長490 nm處的吸光度來評估細(xì)胞活力。轉(zhuǎn)染后的SW480及HT-29細(xì)胞也按如上程序處理。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)分析 使用凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。將5×105轉(zhuǎn)染的SW480及HT-29細(xì)胞接種到6孔板中，分別給予不同濃度的5-FU處理48 h。隨后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，并重懸于100 μl結(jié)合緩沖液中。然后將細(xì)胞用5 μl FITC和5 μl PI在室溫下雙染15 min。使用流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 miR-346及SFRP4對5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞毒性的影響 MTT法結(jié)果表明，與空白對照(0 μg/ml)對比，給予不同濃度梯度(400、800、1 200、1 600、2 000 μg/ml)5-FU培養(yǎng)48 h的SW480及HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率均下降，為劑量依賴性，在1 200、1 600、2 000 μg/ml濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。

與NC組相比，上調(diào)SFRP4表達(dá)或5-FU處理后，SW480和HT-29細(xì)胞存活率均下降，而上調(diào)SFRP4表達(dá)與5-FU同時處理后細(xì)胞活力降低最為顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。

CCK-8結(jié)果顯示，與Con-miR組相比，外源性miR-346不改變細(xì)胞存活率，與Con-miR+5-FU組比較，miR-346+5-FU共同干預(yù)后，SW480和HT-29細(xì)胞活力降低減少，表明miR-346降低了5-FU對結(jié)腸癌細(xì)胞的毒性。分別與miR-346+5-FU、miR-346+Vector組比較，miR-346+SFRP4+5-FU共同干預(yù)后，SW480和HT-29細(xì)胞活力降低有改善，表明SFRP4可能逆轉(zhuǎn)miR-346對5-FU細(xì)胞毒性降低的作用，見圖1C。

圖1 miR-346及SFRP4對5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞毒性的影響

以上研究表明，SFRP4可以增加5-FU誘導(dǎo)的SW480及HT-29細(xì)胞毒性，而miR-346能夠降低5-FU誘導(dǎo)的SW480及HT-29細(xì)胞毒性。

2.2 miR-346及SFRP4對5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞結(jié)果顯示，與NC組比較，上調(diào)SFRP4表達(dá)的pcDNA3.1-SFRP4組誘發(fā)未經(jīng)5-FU處理的SW480、HT-29細(xì)胞凋亡增加，與pcDNA3.1-SFRP4組或NC組比較，pcDNA3.1-SFRP4組聯(lián)合1 200 μg/ml 5-FU處理的SW480和HT-29細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增加(P<0.05)，見圖2A。結(jié)果表明，上調(diào)SFRP4表達(dá)促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。與Con-miR組相比，外源性miR-346不改變細(xì)胞凋亡率，與Con-miR+5-FU組比較，miR-346+5-FU共同干預(yù)后，SW480和HT-29細(xì)胞凋亡減少。結(jié)果表明，miR-346降低了5-FU對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用，分別與miR-346+5-FU、miR-346+Vector組比較，miR-346+SFRP4+5-FU共同干預(yù)后，SW480和HT-29細(xì)胞凋亡率降低有所改善，表明SFRP4可能逆轉(zhuǎn)miR-346對5-FU細(xì)胞凋亡的作用，見圖2B。以上研究表明，SFRP4可以增加5-FU誘導(dǎo)的SW480及HT-29細(xì)胞凋亡，而miR-346能夠降低5-FU誘導(dǎo)的SW480及HT-29細(xì)胞凋亡。

2.3 miR-346對SFRP4表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用 Western blot檢測顯示,與NC組比較，給予miR-346 mimics干擾的SW480及HT-29細(xì)胞SFRP4蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3A。給予miR-346 inhibitor干擾的SW480及HT-29細(xì)胞SFRP4蛋白表達(dá)上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3B。

3 討論

氟尿嘧啶類藥物在結(jié)直腸癌晚期治療、新輔助治療及輔助治療中均為一線推薦藥物，部分患者原發(fā)耐藥，部分患者隨著化療次數(shù)累加而產(chǎn)生多藥耐藥，5-FU是胸腺合成酶抑制劑，錯配修復(fù)能力的強化、藥物產(chǎn)生代謝障礙及細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷等因素都是化療耐藥的因素。miRNA對上游或下游的靶基因具有調(diào)控作用，這些靶基因可能位于化療敏感或耐藥的通路上，從而對化療增敏或耐藥產(chǎn)生影響。在前期研究中，結(jié)腸癌組織及細(xì)胞層面顯示miR346在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)高于正常上皮細(xì)胞及正常結(jié)腸組織，SFRP4在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中低于正常上皮細(xì)胞及結(jié)腸組織，二者具有相關(guān)性。經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測，進(jìn)一步顯示二者具有靶向調(diào)控關(guān)系[7-8]。

圖2 miR-346及SFRP4對5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

注：A.上調(diào)miR-346表達(dá)對SW480及HT-29細(xì)胞凋亡的影響，

B.miR-346對SW480及HT-29細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Western blot檢測給予miR-346 mimics (A)或miR-346 inhibitor (B)干擾的SW480及HT-29細(xì)胞SFRP4蛋白表達(dá)

本研究顯示，給予5-FU培養(yǎng)的SW480及HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率下降，為劑量依賴性。上調(diào)SFRP4表達(dá)后，經(jīng)5-FU處理的SW480和HT-29細(xì)胞存活率會明顯下降，SFRP4對5-FU化療具有增效作用。miR-346及5-FU共同干預(yù)SW480和HT-29細(xì)胞后，細(xì)胞降低減少，表明miR-346降低了5-FU對結(jié)腸癌細(xì)胞的毒性；同時給予miR-346、SFRP4共同干預(yù)5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，細(xì)胞活力降低有改善，表明SFRP4可能逆轉(zhuǎn)miR-346對5-FU細(xì)胞毒性降低的作用。結(jié)果表明，SFRP4可以增加5-FU誘導(dǎo)的SW480及HT-29細(xì)胞毒性，而miR-346能夠降低5-FU誘導(dǎo)的SW480及HT-29細(xì)胞毒性。

本研究進(jìn)一步觀察了miR-346及SFRP4在5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用，結(jié)果顯示，上調(diào)SFRP4表達(dá)對5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡具有增效作用，而miR-346具有相反的作用。二者共同作用于5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率略有回升，表明SFRP4可能逆轉(zhuǎn)miR-346對5-FU細(xì)胞凋亡的作用。以上研究表明，SFRP4可以增加5-FU誘導(dǎo)的SW480及HT-29細(xì)胞凋亡，而miR-346能夠降低5-FU誘導(dǎo)的SW480及HT-29細(xì)胞凋亡。宋敏等[9]研究了miR-215-3p在結(jié)腸癌5-FU耐藥中的作用，結(jié)果顯示，miR-215-3p通過調(diào)控下游CXCR4逆轉(zhuǎn)5-FU耐藥。陳淑蘭等[10]研究顯示，miR-19a通過靶向調(diào)控TP53INP1介導(dǎo)5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌耐藥。另有研究顯示，miR-340及miR-139-5p對結(jié)腸癌化療耐藥均有調(diào)控作用[11-12]。這些研究均表明，miRNA在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用。miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后分析、預(yù)測及治療方面均有重要的作用。Yagi等[13]在液體活檢中采用ex-miRNA-125b監(jiān)測在進(jìn)展期結(jié)直腸癌化療中mFOLFOX6方案耐藥，結(jié)果顯示，miRNA-125b可以有效監(jiān)測化療期間腫瘤耐藥，可作為腫瘤進(jìn)展的早期標(biāo)志物及預(yù)后因素。miR-34a、miR-143、miR-153、miR-27a及miR-218等在結(jié)直腸腫瘤化療耐藥中的作用也得到多項實驗證實，miRNAs發(fā)揮化療耐藥的下游通路及基因包括PI3K/Akt、EMT、p53、p21及ATM等[14]。

本研究結(jié)果顯示，miR-346對SFRP4表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用，但其屬于直接調(diào)控作用還是間接調(diào)控，需進(jìn)一步實驗證明。miR-346通過負(fù)向調(diào)控SFRP4降低5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞毒性，但是否具有靶向應(yīng)用價值，需進(jìn)一步實驗證明。