李黎麗，何勝利

0 引言

杜仲雙降袋泡劑[1]收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十二冊(cè)，由杜仲葉、苦丁茶兩味中藥材加工而成，具有降壓、降脂的功效，主要用于高血壓及高血脂癥的治療?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)方中的任何成分進(jìn)行定量測(cè)定。張小萍等[2]對(duì)杜仲雙降袋泡劑所含綠原酸進(jìn)行了測(cè)定。中成藥復(fù)方制劑所含各成分的最大吸收波長(zhǎng)不同，單一波長(zhǎng)難以同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定多組分的含量。本文采用HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)，選取所測(cè)各成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁和槲皮素的最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，建立了HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定杜仲雙降袋泡劑中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁及槲皮素含量的方法，為杜仲雙降袋泡劑中多種成分含量控制提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1220高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；AG135電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。杜仲雙降袋泡劑(規(guī)格：每袋裝3.5 g，批號(hào)：160702、170305、170512)來(lái)源于貴州神奇藥業(yè)有限公司。對(duì)照品京尼平苷酸(111828-201604，含量97.4%)、綠原酸(110753-201716，含量99.3%)、桃葉珊瑚苷(111761-200601，含量100.0%)、松脂醇二葡萄糖苷(111537-201706，含量91.7%)、蘆丁(100080-201610，含量91.9%)、槲皮素(100081-201610，含量99.1%)來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品京尼平苷(24512-63-8，含量98.0%)來(lái)源于上海純優(yōu)生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Hydrosphere C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫(0～15 min，11.0%A；15～31 min，11.0%A→42.0%A；31～38 min，42.0%A→54.0%A；38～45 min，54.0%A→11.0%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：208 nm[3-4](0～15 min，檢測(cè)桃葉珊瑚苷)、235 nm[5](15～31 min，檢測(cè)京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷)、270 nm[6](31～45 min，檢測(cè)蘆丁和槲皮素)；流速：0.9 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素對(duì)照品適量，用80%甲醇分別制成單個(gè)成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液(各成分質(zhì)量濃度分別為桃葉珊瑚苷2.194 mg/ml、京尼平苷酸1.956 mg/ml、綠原酸1.372 mg/ml、京尼平苷0.494 mg/ml、松脂醇二葡萄糖苷1.622 mg/ml、蘆丁0.918 mg/ml、槲皮素0.370 mg/ml)；依次吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各適量，用80%甲醇制成混合對(duì)照品溶液(各成分質(zhì)量濃度分別為桃葉珊瑚苷109.7 μg/ml、京尼平苷酸97.8 μg/ml、綠原酸68.6 μg/ml、京尼平苷24.7 μg/ml、松脂醇二葡萄糖苷81.1 μg/ml、蘆丁45.9 μg/ml、槲皮素7.4 μg/ml)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取杜仲雙降袋泡劑約1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 ml，密塞，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷至室溫，擦干外壁，用80%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)濾，續(xù)濾液作為杜仲雙降袋泡劑供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 杜仲雙降袋泡劑由杜仲葉、苦丁茶兩味中藥材加工而成，杜仲葉主要含有桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素等成分，苦丁茶主要含有蘆丁和槲皮素等成分。該制劑生產(chǎn)過(guò)程中未加入任何輔料，同時(shí)本文所測(cè)定成分中的蘆丁和槲皮素為杜仲葉、苦丁茶的共有成分，故采用樣品制備溶劑80%甲醇作為陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2.1”～“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、杜仲雙降袋泡劑供試品溶液、陰性樣品溶液各適量，依法進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，陰性對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按照所測(cè)各成分色譜峰計(jì)均不低于3 500，所測(cè)各成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素峰形對(duì)稱(chēng)，分離度均大于1.5，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線性范圍試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，分別置于6個(gè)20 ml量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成所測(cè)各成分25倍濃度差的6個(gè)混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁和槲皮素的峰面積，以所測(cè)各成分質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁和槲皮素的峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。見(jiàn)表1。

2.5 精密度考察 取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，依法連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素的峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果所測(cè)各成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.61%、0.78%、0.83%、1.09%、0.76%、1.02%、1.25%。

圖1 HPLC色譜圖

注：A.混合對(duì)照品溶液，B.杜仲雙降袋泡劑供試品溶液，C.陰性樣品溶液；1.桃葉珊瑚苷，2.京尼平苷酸，3.綠原酸，4.京尼平苷，5.松脂醇二葡萄糖苷，6.蘆丁，7.槲皮素

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性考察 取杜仲雙降袋泡劑樣品(批號(hào)：160702)，按照“2.2.2”項(xiàng)下杜仲雙降袋泡劑供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素的峰面積，計(jì)算所測(cè)各成分含量和RSD值。結(jié)果所測(cè)各成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素含量的RSD值分別為1.05%、1.11%、0.42%、1.37%、1.20%、0.39%、1.56%。

2.7 穩(wěn)定性考察 取杜仲雙降袋泡劑樣品(批號(hào)：160702)的同一供試品溶液，于室溫下0、2、4、6、8、16 h依法進(jìn)樣測(cè)定所測(cè)各成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素的峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果杜仲雙降袋泡劑供試品溶液室溫下16 h內(nèi)穩(wěn)定，所測(cè)各成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.56%、0.81%、0.90%、1.05%、0.78%、1.10%、1.24%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的杜仲雙降袋泡劑(批號(hào)：160702)6份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，分置6個(gè)具塞錐形瓶中，每份分別精密加入0.772 mg/ml桃葉珊瑚苷對(duì)照品溶液4.0 ml、0.904 mg/ml京尼平苷酸對(duì)照品溶液3.0 ml、0.964 mg/ml綠原酸對(duì)照品溶液2.0 ml、0.714 mg/ml京尼平苷對(duì)照品溶液1.0 ml、1.157 mg/ml松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品溶液2.0 ml、0.643 mg/ml蘆丁對(duì)照品溶液2.0 ml、0.216 mg/ml槲皮素對(duì)照品溶液1.0 ml，再按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備加樣回收樣品試液。依法進(jìn)樣檢測(cè)所測(cè)各成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素含量，計(jì)算各成分的回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 杜仲雙降袋泡劑樣品含量測(cè)定 取3批杜仲雙降袋泡劑(批號(hào)：160702、170305、170512)，按照“2.2.2”項(xiàng)下杜仲雙降袋泡劑制備方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁和槲皮素的峰面積，計(jì)算所測(cè)各成分含量。見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 待測(cè)成分的選擇 杜仲雙降袋泡劑是由杜仲葉、苦丁茶兩味中藥材加工而成的中成藥復(fù)方制劑，杜仲葉[7]為杜仲科植物杜仲的干燥葉，主要含有酚類(lèi)(包括苯丙素類(lèi))、黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、木脂素類(lèi)等成分，其中綠原酸為苯丙素類(lèi)主要成分，也是《中國(guó)藥典》2015年版一部杜仲葉項(xiàng)下的定量測(cè)定指標(biāo)性成分，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和京尼平苷為其環(huán)烯醚萜類(lèi)主要化合物，松脂醇二葡萄糖苷為其木脂素類(lèi)主要化合物，蘆丁、槲皮素、山柰酚、異鼠李素等為其所含黃酮類(lèi)主要成分；苦丁茶為木樨草科植物日本女貞的干燥枝葉[1]，主要含黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、皂苷類(lèi)、氨基酸、糖類(lèi)等成分，其中黃酮類(lèi)主要有槲皮素、蘆丁等。本文選取杜仲葉和苦丁茶所含的主要成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素為指標(biāo)，運(yùn)用HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)對(duì)杜仲雙降袋泡劑所含7個(gè)主要成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

表2 桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素回收率

表3 含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 在流動(dòng)相的選擇上，筆者對(duì)不同的流動(dòng)相體系(甲醇-0.05%磷酸溶液[8]、甲醇-0.4%磷酸溶液[9]、甲醇-0.1%冰醋酸溶液[10]、甲醇-0.3%冰醋酸溶液[11]、乙腈-0.1%磷酸溶液[3-5]、乙腈-0.4%磷酸溶液[7])進(jìn)行了對(duì)比考察，以所測(cè)各成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素的峰形、分離度以及所測(cè)各色譜峰基線是否平穩(wěn)等為指標(biāo)，并不斷對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行了摸索，最終優(yōu)選最佳的流動(dòng)相體系：以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件的梯度洗脫比例進(jìn)行洗脫，實(shí)現(xiàn)了對(duì)杜仲雙降袋泡劑中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁和槲皮素的同時(shí)測(cè)定。HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定杜仲雙降袋泡劑中的桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素含量的方法，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于杜仲雙降袋泡劑的質(zhì)量控制。