馬恩慧，文 學(xué)，戴瑩菲，周 潔，吳長宇

（徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，江蘇徐州 221004）

1 引言

參比電極（RE）是一種具有已知恒定電位的電極，能夠?yàn)殡娀瘜W(xué)研究對(duì)象提供一個(gè)電位標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，常用的商業(yè)化參比電極有飽和甘汞電極（SCE）、Ag/AgCl電極等。這些電極通常由導(dǎo)線、電極帽、電極絲、玻璃管、電極液、多孔陶瓷等組成，因而體積也比較大，比如常用的飽和甘汞電極的長度通常大于10cm，末端的直徑也在1cm左右。將其用于構(gòu)成三電極體系進(jìn)行電化學(xué)測量時(shí)，需要較多的電解液體積（通常需要數(shù)毫升），因此不適用于血液、腦脊液等小體積生物樣本的分析。同時(shí)傳統(tǒng)參比電極需要參比內(nèi)液，這必然會(huì)造成漏液等問題，一方面會(huì)污染樣品，另一方面在其使用過程中需要定期更換內(nèi)液[3-5]。

為減小參比電極的尺寸，解決傳統(tǒng)參比電極漏液的問題，本研究設(shè)計(jì)并制備了基于移液器吸頭的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極（ASSmRE），以KCl飽和的瓊脂凝膠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的參比內(nèi)液[6-7]，優(yōu)化了AgCl的成膜時(shí)間，探索了瓊脂凝膠填充方法。同時(shí)通過比較，發(fā)現(xiàn)制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極和飽和甘汞電極具有相近的性能，可以用于電化學(xué)測試。

2 材料與方法

2.1 材料與設(shè)備

氯化鉀、亞鐵氰化鉀、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑（AR）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，銀絲（99.999%）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，瓊脂粉（BR）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

電化學(xué)工作站（CHI 760D，上海辰華儀器有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；金盤電極（Φ 2mm，天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司）；鉑對(duì)電極（上海辰華儀器有限公司）；飽和甘汞電極（上海辰華儀器有限公司）；移液器吸頭（白色，10μL，范德（北京）生物科技有限責(zé)任公司）。

2.2 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備

微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備過程如圖1所示，包括銀絲的處理、KCl飽和瓊脂溶膠的配制、KCl飽和瓊脂凝膠的填充、微型全固態(tài)參比電極的封裝等步驟。

圖1 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備過程示意圖

2.2.1 銀絲的處理

取約15cm長銀絲，將其一端沒入裝有84消毒液（次氯酸溶液）的玻璃瓶中浸泡。待銀絲表面變成灰白色后取出，用去離子水沖洗干凈并晾干。將銀絲的灰色部分置入小號(hào)的移液器吸頭（10μL）內(nèi)，露出的部分纏繞在白色吸頭上端，并用膠帶固定防止銀絲脫落。

2.2.2 KCl飽和瓊脂溶膠的配制

將10mL去離子水加入到燒杯中，置于電爐上加熱，逐漸加入KCl固體，使用玻璃棒攪拌，使溶質(zhì)逐漸溶解，直至溶液中有些許KCl溶質(zhì)不再溶解后停止加入。用電子天平稱取0.36g瓊脂粉，加入到沸騰的KCl溶液中，用玻璃棒攪拌并繼續(xù)加熱保持沸騰，形成KCl飽和瓊脂溶膠。

2.2.3 KCl飽和瓊脂凝膠的填充

使用注射器（去掉針頭）吸取沸騰的KCl飽和瓊脂溶膠，迅速注入置有銀絲的白色吸頭中，可以多次注入瓊脂溶膠，以壓實(shí)白色吸頭內(nèi)的瓊脂，待冷卻后即完成吸頭內(nèi)KCl飽和瓊脂凝膠的填充，用作微型全固態(tài)參比電極的導(dǎo)電介質(zhì)。

2.2.4 微型全固態(tài)參比電極的封裝

另取一個(gè)白色吸頭，用刀截去其底部。將截去底部的吸頭倒置，和KCl飽和瓊脂凝膠填充后的白色吸頭以“上端對(duì)上端”的形式相對(duì)接，并將銀絲從截去底部的吸頭中抽出；將704硅橡膠擠入截去底部的吸頭內(nèi)，等待硅膠硬化；將熱縮管套在兩個(gè)白色吸頭的對(duì)接處，用熱風(fēng)槍加熱使其逐漸縮緊，以使得兩個(gè)白色吸頭牢靠地連在一起；將抽出的銀絲纏繞在銅線的一端，并用電烙鐵焊接起來；最后取直徑合適的熱縮管套在焊錫處，加熱使其縮緊，基于移液器吸頭的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極制作完成。

2.3 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的性能測試

2.3.1 參比電極的穩(wěn)定性測試及參考電位的確定

本實(shí)驗(yàn)使用CHI 760D電化學(xué)工作站，借助循環(huán)伏安法（CV），通過與商業(yè)化的飽和甘汞電極進(jìn)行對(duì)比，測試了該微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的性能。以金電極為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，分別以飽和甘汞電極以及制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為參比電極，測得鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜圖，比較其峰電流、峰電位、表觀電位等參數(shù)，同時(shí)來確定微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的參比電位。將循環(huán)伏安譜的掃描圈數(shù)設(shè)置成10圈，測試連續(xù)掃描時(shí)的峰電位和峰電流的變化趨勢(shì)，以驗(yàn)證該微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的穩(wěn)定性。

以微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極構(gòu)成回路來測量開路電壓（OCP），即微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極和飽和甘汞電極之間的參考電位差。將制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極放置30d，并測試其開路電壓，確定其長期穩(wěn)定性。

2.3.2 不同掃描速度時(shí)鐵氰化鉀溶液的電化學(xué)響應(yīng)

以金電極為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，分別以飽和甘汞電極以及制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為參比電極，分別測定掃描速度為10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250mV/s時(shí)鐵氰化鉀溶液（1mM）的循環(huán)伏安譜，并比較二者的差異。

2.3.3 不同濃度鐵氰化鉀溶液的電化學(xué)響應(yīng)

以飽和甘汞電極為參比電極，在掃描速度保持不變的條件下，改變鐵氰化鉀溶液濃度（1.000、0.889、0.800、0.727、0.667、0.671、0.533、0.500mM），依次進(jìn)行掃描獲得循環(huán)伏安譜。將飽和甘汞電極換成制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極，同樣獲得上述不同濃度鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備

在微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備過程中，使用84消毒液浸泡銀絲的一端，浸泡一段時(shí)間后銀絲表面會(huì)呈現(xiàn)灰白色。84消毒液的主要成分為次氯酸鈉（NaClO），水解后生成不穩(wěn)定的次氯酸，進(jìn)而分解為氯化氫等物質(zhì)。因此銀絲表面可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)是：

而當(dāng)銀絲浸泡時(shí)間過長時(shí)會(huì)逐漸變成黑色，可能原因有兩個(gè)：銀絲氧化為氧化銀而顯黑色；AgCl見光分解生成的Ag顆粒顯黑色。因此浸泡時(shí)間選為5min。

在給置入銀絲后的吸頭中注入熱的KCl飽和瓊脂溶膠時(shí)，冷卻為固態(tài)的凝膠，但其內(nèi)部以及和吸頭管壁間容易產(chǎn)生氣泡或者間隙，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過程中離子交換不能順利進(jìn)行，從而導(dǎo)致所制作的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極出現(xiàn)參考電位穩(wěn)定性不強(qiáng)的問題。優(yōu)化方法是在注入加熱的KCl飽和的瓊脂溶膠時(shí)，將洗頭的尖端堵住，然后用注射器將KCl飽和瓊脂溶膠緩慢地注入并壓實(shí)，以保證瓊脂溶膠在槍頭中壓實(shí)并無氣泡空隙產(chǎn)生。

制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極如圖2所示。在使用時(shí)將吸頭的尖端沒入電解質(zhì)溶液作為參比電極，注意液面不要沒過熱縮管，防止溶液爬升，腐蝕銀絲及銅導(dǎo)線，進(jìn)而污染電極。此外，和其他參比電極類似，需要將微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極浸泡在飽和KCl溶液中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，防止干涸產(chǎn)生氣泡。

圖2 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極實(shí)物圖

3.2 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的性能測試

參比電極通常需要具有穩(wěn)定的電勢(shì)，才能保證電化學(xué)測量的準(zhǔn)確性。在完成微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備后，通過與商業(yè)化的飽和甘汞電極對(duì)比，使用循環(huán)伏安法研究了該電極的性能。

3.2.1 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的參比電位

通過與商業(yè)化的飽和甘汞電極進(jìn)行比對(duì)，確定了微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的參比電位[8]。從圖3和表1中可以看出，兩個(gè)電極作為參比電極所測出的循環(huán)伏安譜圖，峰電流大小幾乎沒有變化，但峰電位有明顯的不同。當(dāng)飽和甘汞電極作為參比電極時(shí)，鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜圖具有一定的對(duì)稱性，表現(xiàn)出可逆的氧化還原特性，其中峰電位差ΔEp為0.151V，表觀電位Eo為0.162V。當(dāng)用微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極作為參比電極時(shí)，鐵氰化鉀的循環(huán)伏安譜圖同樣具有一定的對(duì)稱性，ΔEp為0.126V，Eo為0.210V。相對(duì)于飽和甘汞電極，微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極作為參比電極時(shí)鐵氰化鉀的氧化還原峰電位向正電位方向移動(dòng)。微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極（ASSmRE）和飽和甘汞電極（SCE）之間的參比電位差可以通過鐵氰化鉀的表觀電位計(jì)算得到：

表1 不同參比電極時(shí)，鐵氰化鉀循環(huán)伏安譜圖的峰電位參數(shù)的對(duì)比

圖3 不同參比電極時(shí)，鐵氰化鉀溶液（0.8mM）的循環(huán)伏安譜圖

參比電極為飽和甘汞電極和微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極，掃描速度為50mV/s。

3.2.2 連續(xù)掃描時(shí)的穩(wěn)定性測試

將制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極作為參比電極，在鐵氰化鉀中進(jìn)行了連續(xù)10圈的循環(huán)伏安譜掃描，采集了每次掃描的峰電位和峰電流。如圖4所示，連續(xù)掃描中每次掃描的氧化還原反應(yīng)的峰電流和峰電位基本保持不變，其中峰電位的大小波動(dòng)約2mV（0.92%）。因此，微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極在連續(xù)掃描時(shí)具有較好的穩(wěn)定性，可以用作參比電極。

金盤電極為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為參比電極，掃描速度為50mV/s。

3.2.3 長期穩(wěn)定性測試

制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極需要放置在飽和KCl溶液中，以保持其穩(wěn)定性。本文還研究了微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的長期穩(wěn)定性。以制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極測定其在飽和KCl溶液中的開路電壓[8]。結(jié)果如圖5所示，微型全固態(tài)Ag/AgCl電極電位在100s左右達(dá)到穩(wěn)定，與飽和甘汞電極相差48.09mV，與循環(huán)伏安法的結(jié)果一致。圖5中插圖為30d內(nèi)參比電位的變化趨勢(shì)圖，結(jié)果顯示微型全固態(tài)Ag/AgCl電極電位在30d內(nèi)波動(dòng)為0.28mV（0.33%），表明該參比電極穩(wěn)定性良好，可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

3.2.4 不同掃描速度時(shí)鐵氰化鉀溶液的電化學(xué)響應(yīng)

進(jìn)一步研究了在不同掃描速度下、以微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為參比電極時(shí)鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜，結(jié)果如圖6A所示。結(jié)果表明，鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜中峰電流均隨著掃描速度的增大而增大。以掃描速度為橫坐標(biāo)，以峰電流為縱坐標(biāo)作圖（圖6B），可以看出峰電流和掃描速度滿足著一定的線性關(guān)系。同時(shí)以掃描速度的平方根為橫坐標(biāo)，以峰電流為縱坐標(biāo)作圖（圖6C），結(jié)果顯示峰電流與掃描速度的平方根有著很好的線性關(guān)系，其擬合方程是ip，1=0.253+41.732×υ1/2（R2=0.997 7） 和ip，2=-2.545-20.149×υ1/2（R2=0.992 4）。 這 表明鐵氰化鉀在電極上的電化學(xué)行為是受擴(kuò)散控制的[9-10]，這和以飽和甘汞電極為參比電極的結(jié)果是一致的。這些結(jié)果也進(jìn)一步地證明了微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極具有較好的性能。

圖4 在鐵氰化鉀（1mM）中連續(xù)掃描10圈時(shí)的循環(huán)伏安譜（A）以及峰電流（B）和峰電位（C）的變化趨勢(shì)圖

圖5 在飽和KCl溶液中的開路電壓-時(shí)間曲線圖

圖6 不同掃描速度情況下，鐵氰化鉀（1mM）溶液的循環(huán)伏安譜

金盤電極為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為參比電極。

3.2.5 不同濃度鐵氰化鉀溶液的電化學(xué)響應(yīng)

本論文還研究了微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極作為參比電極時(shí)不同濃度鐵氰化鉀的電化學(xué)響應(yīng)。如圖7A所示，隨著鐵氰化鉀濃度的增加，循環(huán)伏安譜的峰電流也逐漸增加。如圖7B所示，峰電流和鐵氰化鉀濃度呈現(xiàn)著線性關(guān)系，即ip,1=0.959+9.076×c（R2=0.993 3） 和ip,2=-0.696-7.570×c（R2=0.983 9）。這些結(jié)果與以飽和甘汞電極為參比電極的結(jié)果是一致的，也說明微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的性能較好，可以用于電化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

圖7 在微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極分別作為參比電極時(shí)，不同濃度鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜（A）及峰電流與濃度的關(guān)系曲線（B）

金盤電極為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極，掃描速度為50mV/s。

4 結(jié)論

設(shè)計(jì)并制備了基于移液器吸頭的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極，具有制作方便、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，解決了傳統(tǒng)參比電極尺寸較大、存在漏液等問題。通過比較發(fā)現(xiàn)，制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極和飽和甘汞電極具有相近的性能，具有較好的短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性，鐵氰化鉀溶液在該參比電極組成的電化學(xué)體系中具有良好的電化學(xué)響應(yīng)。因此制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極可以用于電化學(xué)測試。