李沁愷 沙 桐 蘇存錦 胡端敏&

蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科1(215000) 藥劑科2

背景：氧化應(yīng)激在電離輻射引起的腸道損傷和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。?；撬崾且环N廣泛分布于體內(nèi)的含硫氨基酸，具有抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)功能。目的：研究牛磺酸對放射性腸損傷的治療作用及其潛在機(jī)制。方法：以CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)熒光探針DCFH-DA檢測?；撬釋﹄婋x輻射引起的人腸上皮細(xì)胞株HIEC-6活力抑制和ROS蓄積的影響。以real-time PCR檢測?；撬釋w內(nèi)、外輻射暴露后腸道細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。以HE染色和TUNEL染色評估?；撬釋θ磔椛浜笮∈竽c道形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡的改善作用。結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)中，?；撬峥娠@著改善電離輻射引起的HIEC-6細(xì)胞活力抑制和細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，并上調(diào)過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，牛磺酸能激活核因子E2相關(guān)因子2/血紅素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信號通路，減輕輻射暴露引起的小腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂和腸隱窩丟失，抑制腸道細(xì)胞凋亡。結(jié)論：牛磺酸可能通過激活Nrf2/HO-1抗氧化信號通路降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，對電離輻射引起的腸道損傷發(fā)揮保護(hù)作用，是一種可用于治療放射性腸損傷的潛在藥物。

電離輻射對于一些惡性腫瘤有較好的治療效果，但也會造成周圍健康組織損傷[1]，放射治療引起的多種胃腸道癥狀，如便血、腹瀉、吸收不良、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛等嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2-3]。因此，減輕放射治療的毒性反應(yīng)以提高患者生活質(zhì)量在腫瘤治療期間至關(guān)重要?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，其在生理狀態(tài)下參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝，過多則對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用[4]。電離輻射與生物分子之間相互作用產(chǎn)生的ROS是引起放射性損傷的重要因素[5-6]。電離輻射造成的細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積引起氧化應(yīng)激、線粒體膜通透性變化、DNA損傷、細(xì)胞凋亡以及炎癥相關(guān)信號通路激活和促炎細(xì)胞因子分泌增加、抗炎細(xì)胞因子分泌減少，是放射性腸損傷的關(guān)鍵病理生理環(huán)節(jié)[7-10]。?；撬?taurine)是一種結(jié)構(gòu)簡單的含硫氨基酸，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種生物學(xué)功能，研究顯示其可明顯改善輻射引起的腎、腦、睪丸、肺等組織器官損傷[5,11-13]。本研究通過體、內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討牛磺酸對放射性腸損傷的治療作用及其潛在機(jī)制，以期為?；撬釕?yīng)用于放射性腸病的臨床治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑

正常人腸上皮細(xì)胞株HIEC-6(上海雅吉生物科技有限公司)以RPMI-1640培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清、1%青-鏈霉素配制成完全培養(yǎng)基)，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。

6～8周齡雄性Balb/c小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司)平均體質(zhì)量約20 g，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，溫度20～25 ℃，相對濕度30%～50%，12 h明暗周期，自由攝取飼料和飲水。動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)蘇州大學(xué)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

?；撬?上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒、細(xì)胞核熒光染料DAPI、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(顯色法；上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞內(nèi)ROS熒光探針DCFH-DA(MedChem-Express.)；TRIzolTM試劑(InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific)；SYBR Premix EX Taq(Perfect Real Time; Takara Bio Inc.)。

二、方法

1. 體外實(shí)驗(yàn)

①細(xì)胞活力檢測：HIEC-6細(xì)胞以每孔1×104個接種于96孔培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁。將牛磺酸分別配制成40 mmol/L和100 mmol/L濃度的溶液。將細(xì)胞分為四組：對照組(CON組)、輻射組(RAD組)和RAD+TAU(40 mmol/L)組、RAD+TAU(100 mmol/L)組，后兩組每孔培養(yǎng)基中加入10 μL配制好的?；撬崛芤海囵B(yǎng)12 h后予電離輻射處理(X射線輻照，照射劑量10 Gy，劑量率0.98 Gy/min)；輻射處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑后培養(yǎng)2 h，以酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(A值)。細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個復(fù)孔，結(jié)果取均值。

②細(xì)胞內(nèi)ROS檢測：以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基將ROS熒光探針DCFH-DA按1∶1 000的比例稀釋，濃度為10 μmol/L。電離輻射后6 h，各組HIEC-6細(xì)胞去除培養(yǎng)基，加入含DCFH-DA熒光探針的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min；去除培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次以充分洗去未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA；于培養(yǎng)孔中加入細(xì)胞核熒光染料DAPI避光染色10 min；PBS洗滌1次，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

③Real-time PCR檢測氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)：電離輻射后6 h，TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書配制逆轉(zhuǎn)錄體系，合成第一鏈cDNA，以之為模板，使用Applied Biosystems 7500快速實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)行real-time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系的配制和反應(yīng)條件參照SYBR Premix EX Taq (Perfect Real Time)說明書，引物序列見表1。內(nèi)參照基因使用GAPDH，以2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

2. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

①動物分組和造模：將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為三組：對照組(CON組)、全身輻射組(RAD組)和全身輻射+?；撬岣深A(yù)組(RAD+TAU組)，每組6只。X射線全身輻射劑量為10 Gy，劑量率為 0.98 Gy/min。RAD+TAU組和RAD組分別于X射線照射前3 d開始每日1次腹腔注射?；撬? 000 mg/kg或等體積0.9% NaCl溶液，照射當(dāng)日于照射前30 min腹腔注射一次，照射后繼續(xù)每日腹腔注射；對照組小鼠不予X射線照射，僅予腹腔注射0.9%NaCl溶液。照射后3.5 d處死小鼠(處死當(dāng)日不予腹腔注射)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

②小腸組織獲取：4%水合氯醛麻醉小鼠，剪開胸腔，分離心臟，由心尖入針，剪開右心耳，0.9% NaCl溶液灌流全身。于距盲腸1 cm處取小腸組織，用于real-time PCR檢測。4%多聚甲醛灌注直至小鼠四肢僵硬，另選擇一段小腸取材，4%多聚甲醛固定待測。

③Real-time PCR檢測小腸組織CAT基因表達(dá)：方法同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

④組織病理學(xué)檢查和細(xì)胞凋亡檢測：小腸組織標(biāo)本以4%多聚甲醛固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，垂直于腸管橫截面4 μm厚連續(xù)切片，行HE染色，并參照試劑盒說明書行TUNEL染色，觀察小腸組織病理學(xué)變化和細(xì)胞凋亡情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、?；撬岣纳齐婋x輻射引起的人腸上皮細(xì)胞活力抑制

選擇人腸上皮細(xì)胞株HIEC-6作為研究對象，通過體外實(shí)驗(yàn)研究?；撬犷A(yù)處理對電離輻射引起的腸道細(xì)胞活力抑制的影響。既往研究顯示?；撬岬募?xì)胞毒性很小，故直接選用40 mmol/L和 100 mmol/L兩個劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 Gy電離輻射可顯著抑制HIEC-6細(xì)胞活力，與未予?；撬犷A(yù)處理者相比，經(jīng)100 mmol/L?；撬犷A(yù)處理的HIEC-6細(xì)胞活力明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖1)，表明100 mmol/L?；撬峥筛纳齐婋x輻射引起的人腸上皮細(xì)胞活力抑制。后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)步驟均使用100 mmol/L?；撬?。

**與CON組比較，P<0.01；#與RAD組比較，P<0.05

二、?；撬峤档碗婋x輻射后人腸上皮細(xì)胞內(nèi)的ROS水平

ROS熒光探針DCFH-DA檢測顯示，與未經(jīng)電離輻射者相比，輻射暴露后的HIEC-6細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，?；撬犷A(yù)處理則可有效抑制輻射引起的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高(圖2)，表明牛磺酸可降低電離輻射后人腸上皮細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。

三、?；撬嵴{(diào)節(jié)電離輻射后氧化應(yīng)激相關(guān)酶表達(dá)

為進(jìn)一步探索牛磺酸對氧化還原平衡的影響，研究采用real-time PCR檢測了電離輻射后氧化應(yīng)激相關(guān)酶的體內(nèi)、外表達(dá)水平。體外實(shí)驗(yàn)中，輻射暴露后的HIEC-6細(xì)胞內(nèi)抗氧化分子CAT、GPx1 mRNA相對表達(dá)量明顯降低，?；撬犷A(yù)處理則可有效上調(diào)兩者表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖3A、3B)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與未予全身輻射的小鼠相比，輻射后3.5 d小鼠小腸組織CAT mRNA相對表達(dá)量明顯降低，?；撬岣深A(yù)則可上調(diào)CAT mRNA表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖3C)。

四、牛磺酸激活Nrf2信號通路調(diào)控氧化應(yīng)激保護(hù)小鼠腸道細(xì)胞

基于?；撬釋ρ趸瘧?yīng)激相關(guān)酶的調(diào)節(jié)作用，研究進(jìn)一步探討了?；撬釋ρ趸瘧?yīng)激系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子之一，可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)下游抗氧化因子表達(dá)，對細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[14]。Real-time PCR檢測顯示，與未予全身輻射的小鼠相比，輻射后3.5 d小鼠小腸組織Nrf2 mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，這可能是由于輻射導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Nrf2信號通路激活，Nrf2表達(dá)代償性增加，?；撬岣深A(yù)則可進(jìn)一步上調(diào)Nrf2 mRNA表達(dá)(P<0.05)，Nrf2下游靶基因HO-1的表達(dá)變化與之相一致(圖4)。

五、?；撬峋S持全身輻射后小鼠腸上皮結(jié)構(gòu)的完整性

本實(shí)驗(yàn)步驟評估了牛磺酸對全身輻射后小鼠小腸結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。輻射后3.5 d小鼠小腸出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為腸壁充血、水腫、變薄、褶皺減少，腸內(nèi)容物變??；經(jīng)?；撬岣深A(yù)的輻射暴露后小鼠無論是腸壁情況還是腸內(nèi)容物均有明顯改善(圖5A)。HE染色顯示，輻射后3.5 d小鼠小腸上皮出現(xiàn)不同程度的絨毛短縮和腸隱窩丟失，腸絨毛部分缺如、絨毛結(jié)構(gòu)紊亂；牛磺酸干預(yù)則可部分恢復(fù)小腸絨毛和腸隱窩的完整性(圖5B)。上述發(fā)現(xiàn)表明，?；撬峥蓽p輕全身輻射引起的腸道結(jié)構(gòu)紊亂。

六、?；撬嵋种迫磔椛浜笮∈竽c道細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是輻射暴露后腸道細(xì)胞死亡的關(guān)鍵機(jī)制，凋亡導(dǎo)致的絨毛上皮細(xì)胞和隱窩干細(xì)胞丟失是腹部和盆腔放射治療引起胃腸道綜合征的重要原因[15]。本研究TUNEL染色顯示，與未予全身輻射的小鼠相比，輻射后3.5 d小鼠小腸隱窩內(nèi)有大量染為褐色的凋亡細(xì)胞，?；撬岣深A(yù)則可顯著改善小腸隱窩和絨毛細(xì)胞凋亡(圖6)。上述發(fā)現(xiàn)表明，?；撬峥蓽p少全身輻射引起的腸道細(xì)胞凋亡。

討 論

本研究探討了牛磺酸對放射性腸損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，研究結(jié)果表明，?；撬峥赏ㄟ^上調(diào)抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶表達(dá)而減少輻射暴露后人腸上皮細(xì)胞內(nèi)的ROS蓄積。具體而言，牛磺酸可激活Nrf2/HO-1信號通路，發(fā)揮抗氧化作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛磺酸可減輕全身輻射引起的腸道損傷，維持腸上皮結(jié)構(gòu)完整性，減少腸道細(xì)胞凋亡。上述發(fā)現(xiàn)為?；撬嵊糜诜派湫阅c損傷的治療提供了理論依據(jù)。

藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，綠色熒光為ROS陽性細(xì)胞

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01

ROS在電離輻射引起的腸道損傷和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[7-10]。ROS主要由線粒體產(chǎn)生，細(xì)胞呼吸過程中，線粒體呼吸鏈“電子漏”會使少量電子與氧直接結(jié)合產(chǎn)生超氧陰離子O2-，即初級ROS，并在歧化酶的催化下繼續(xù)形成H2O2[16]。細(xì)胞暴露于電離輻射時，線粒體膜電位發(fā)生變化，線粒體膜損傷導(dǎo)致ROS產(chǎn)生進(jìn)一步增加[17]。而ROS的蓄積又可促進(jìn)線粒體功能障礙，導(dǎo)致持續(xù)的氧化應(yīng)激，形成惡性循環(huán)[7]。為保護(hù)自身免于ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，細(xì)胞會啟動主要基于酶類的抗氧化防御體系，如CAT和GPx以維持氧化還原平衡[18]。

A：小腸組織大體圖；B：HE染色圖(×40)

?；撬釓V泛分布于腦、脊髓、心臟、肌肉細(xì)胞和視網(wǎng)膜中，是在幾乎所有組織器官中含量均較為豐富的氨基酸之一[19]。作為一種調(diào)節(jié)機(jī)體正常生理活動的活性物質(zhì)，?；撬嵩谏窠?jīng)、心血管、腎臟、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種生理功能和藥理作用。其細(xì)胞保護(hù)特性表現(xiàn)在細(xì)胞的發(fā)育、營養(yǎng)、存活等諸多方面。此外，?；撬徇€具有抗氧化功能。在糖尿病引起的腎臟損傷中，牛磺酸可降低血糖、促炎細(xì)胞因子和腎臟氧化應(yīng)激水平，減少細(xì)胞凋亡，改善腎功能[20]。?；撬徇€可通過多種機(jī)制改善多種生理或病理情況下的認(rèn)知功能損害，包括減輕神經(jīng)炎癥、上調(diào)Nrf2表達(dá)和抗氧化能力、激活A(yù)kt/CREB/PGC1α信號通路以進(jìn)一步增強(qiáng)線粒體生物合成、突觸功能、減少氧化應(yīng)激等[21]。上述發(fā)現(xiàn)表明，?；撬峋哂斜Ｗo(hù)多種組織器官免于氧化應(yīng)激損傷的作用。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上探討了牛磺酸對放射性腸損傷的保護(hù)作用。

?；撬嵩趧游锛?xì)胞線粒體中發(fā)揮重要的抗氧化作用[22]。細(xì)胞內(nèi)?；撬岬南目赡軙?dǎo)致牛磺酸修飾的線粒體tRNA減少，從而損害呼吸鏈的電子傳遞能力，電子由呼吸鏈轉(zhuǎn)移至氧，形成超氧陰離子，而恢復(fù)?；撬崴娇苫謴?fù)呼吸鏈活性，降低細(xì)胞內(nèi)ROS(超氧陰離子)水平[23-24]。對放射性腎損傷的研究表明，?；撬峥赡芡ㄟ^改善線粒體功能障礙抑制ROS，從而減輕電離輻射引起的腎損傷[5]。由此推測在放射性腸損傷中，?；撬峥赡芡瑯邮峭ㄟ^調(diào)節(jié)線粒體功能抑制ROS，促進(jìn)電離輻射引起的腸損傷的恢復(fù)。本研究體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一推測，牛磺酸確可抑制輻射暴露后人腸上皮細(xì)胞的ROS產(chǎn)生，上調(diào)抗氧化酶CAT、GPx1表達(dá)，并改善細(xì)胞活力。

Nrf2是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的上游信號通路因子，被認(rèn)為是細(xì)胞維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，在控制外部因素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[14]。正常情況下，Nrf2分布于細(xì)胞質(zhì)中，與Keap1結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而被泛素化降解；細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時，Nrf2通過磷酸化與Keap1解離并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動子區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, ARE)結(jié)合，上調(diào)下游靶基因表達(dá)[25-26]，如HO-1、CAT、GPx1等，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡作用。研究證實(shí)Nrf2信號通路激活可保護(hù)細(xì)胞免受輻射損傷，其機(jī)制可能與減少輻射后產(chǎn)生的氧自由基有關(guān)[8,12,26-27]。對小鼠精母細(xì)胞的研究[12]表明，牛磺酸對電離輻射引起的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。另有研究顯示，阿魏酸和鬼臼屬植物根莖提取物對輻射暴露造成的胃腸道和造血系統(tǒng)損害發(fā)揮保護(hù)作用亦與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)[8,27]。但目前尚無研究表明?；撬峥赏ㄟ^激活Nrf2/HO-1抗氧化信號通路逆轉(zhuǎn)電離輻射引起的腸道損傷。因此，本研究在明確了?；撬峥赏ㄟ^調(diào)節(jié)CAT和谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用后，推測這一作用的發(fā)揮同樣是由Nrf2信號通路所介導(dǎo)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)全身輻射后，小鼠腸道細(xì)胞中的Nrf2/HO-1信號通路激活，而?；撬岣深A(yù)可進(jìn)一步上調(diào)Nrf2及其靶基因HO-1表達(dá)，CAT表達(dá)亦明顯上調(diào)，輻射暴露引起的小腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂、腸隱窩丟失和細(xì)胞凋亡部分逆轉(zhuǎn)，證實(shí)?；撬峥赏ㄟ^激活Nrf2/HO-1信號通路減輕放射性腸損傷。

綜上所述，本研究探索并驗(yàn)證了?；撬釋Ψ派湫阅c損傷的治療作用及其潛在機(jī)制。牛磺酸可能通過激活Nrf2/HO-1抗氧化信號通路降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平、保護(hù)腸道細(xì)胞、維持正常腸道結(jié)構(gòu)，對電離輻射引起的腸道損傷發(fā)揮保護(hù)作用，是一種可用于治療放射性腸損傷的潛在藥物。