張 庚，張笑玲，孟義江，靳小莎，李 會(huì)，葛淑俊

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/華北作物種質(zhì)資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000）

掌葉半夏（Pinellia pedatisecta Schott），又名虎掌，是天南星科（Araceae）半夏屬（Pinellia）多年生草本植物，以干燥塊莖入藥，有祛風(fēng)止痙、化痰散結(jié)、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效，抗腫瘤，抗驚厥，對(duì)中樞系統(tǒng)有影響，藥用歷史久遠(yuǎn)［1］。

掌葉半夏作為歷代藥用天南星的正品優(yōu)質(zhì)藥材來源，已在全國(guó)大面積栽培［2］，陜西漢中地區(qū)有悠久的栽培歷史，江蘇宿遷縣年栽培面積也較大，河北安國(guó)是古冀州虎掌的老產(chǎn)區(qū)，也有大面積種植［3］。但多年來掌葉半夏相關(guān)工作主要集中于栽培管理、臨床應(yīng)用和化學(xué)成分上［4-6］，在種質(zhì)資源和遺傳育種等方面研究薄弱，關(guān)于掌葉半夏的開花物候和繁育系統(tǒng)尚未見報(bào)道。

植物的傳粉機(jī)制和交配系統(tǒng)受花部形態(tài)、開花物候和花序結(jié)構(gòu)的影響［7-8］，其花部形態(tài)和交配系統(tǒng)是繁育系統(tǒng)的核心。植物的繁育系統(tǒng)從異花授粉進(jìn)化為自花授粉是一個(gè)普遍的進(jìn)化轉(zhuǎn)折［9］。由于近交衰退的存在，植物已經(jīng)進(jìn)化出各種方法避免自交。因此，嚴(yán)格自交的植物很少見。到目前為止所能查到的物種的繁育系統(tǒng)的數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)異花授粉植物可以自花授粉，大部分自花授粉植物也可以異交，即混合交配系統(tǒng)在自然界中廣泛存在［10-11］。

本研究以掌葉半夏栽培種為材料，通過調(diào)查開花物候規(guī)律、測(cè)定花粉活力和柱頭可授性、人工控制授粉統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率等研究揭示該植物的繁育系統(tǒng)類型，以期為種子繁育和雜交育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

掌葉半夏塊莖購(gòu)自河北省安國(guó)市中藥材種子市場(chǎng)，經(jīng)安國(guó)市科技局叩根來高級(jí)農(nóng)藝師鑒定為掌葉半夏（Pinellia pedatisecta Schott）。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2015—2017 年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。將掌葉半夏塊莖晾曬后栽種。每畝（667 m2）施1 000 kg 充分腐熟的農(nóng)家肥，深翻整地耙平，按行距30 cm 開溝，將塊莖按株距10 cm 擺放，芽頭沖上。覆土5 cm 左右。其余管理同大田。

1.2.1 掌葉半夏花部特征及開花物候觀察 掌葉半夏的開花物候觀察從佛焰苞出土開始持續(xù)到果實(shí)成熟結(jié)束。在散粉前，選取30 株佛焰花序掛牌標(biāo)記，測(cè)量雄花序和雌花序直徑、花序柄和附屬器長(zhǎng)度、柱頭和花藥的空間位置，記錄佛焰苞各部分的顏色和結(jié)構(gòu)。將子房明顯膨大作為坐果標(biāo)志，將果實(shí)自然落地作為果實(shí)成熟標(biāo)志。

1.2.2 花粉活力的測(cè)定方法 采用TTC 法、I2-KI 法、MTT 法和離體萌發(fā)法分別對(duì)掌葉半夏花粉活力進(jìn)行測(cè)定［12］。使用添加不同濃度蔗糖和硼酸的改良BK基本培養(yǎng)基進(jìn)行離體培養(yǎng)花粉?；綛K 培養(yǎng)基組成為：100 mg/L H3BO3, 300 mg/L Ca(NO3)2·4H2O, 200 mg/L MgSO4·7H2O, 100 mg/L KNO3和10% 蔗糖 (w/v)。

離體萌發(fā)法試驗(yàn)中，蔗糖設(shè)4 個(gè)濃度(5%、 10%、 15%、 20%, w/v)，硼酸設(shè)4 個(gè)濃度(50、100、250、500 mg/L, w/v; 表3 )，每個(gè)濃度3 次重復(fù)。離體萌發(fā)法培養(yǎng)條件：33℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5 h后在10×顯微鏡下觀察，以花粉管長(zhǎng)度大于花粉粒直徑為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)［13］，記錄萌發(fā)花粉數(shù)和未萌發(fā)花粉數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率。

萌發(fā)率（%）= 每個(gè)視野中萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%

觀察3 個(gè)不同視野，取平均值。

化工技能型人才培養(yǎng)模式研究與實(shí)踐…………………………………………周西臣，馬 勇，蔣秀燕，徐 鳴，于穎敏（2.71）

1.2.3 不同開花天數(shù)花粉活力的測(cè)定 對(duì)花藥尚未開裂的花序進(jìn)行標(biāo)記，分別在散粉第1 天、第2 天、第3 天、第4 天收集花粉，采用1.2.2 離體萌發(fā)法測(cè)定花粉活力，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 柱頭可授性檢測(cè) 采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法(1% 聯(lián)苯 胺∶3%H2O2∶水=4∶11∶22，v/v)［14］。收集不同時(shí)期的柱頭，相同時(shí)期的柱頭每5 個(gè)為1 組，重復(fù)3 組。若柱頭周圍的反應(yīng)液呈現(xiàn)藍(lán)色并有大量氣泡出現(xiàn)，則柱頭具可授性，氣泡數(shù)越多表明柱頭可授性越強(qiáng)。

1.2.5 繁育系統(tǒng)檢測(cè) 按照Amots Dafni［15］的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行掌葉半夏花序直徑、花朵大小和開花行為的測(cè)量和繁育系統(tǒng)的評(píng)判。具體方法是：（1）花朵或花序直徑＜ 1 mm 記為0，1 ～2 mm 記為1，2 ～ 6 mm 記為2，＞ 6 mm 記為3；（2）花藥開裂時(shí)間與柱頭可授期之間的時(shí)間間隔，同時(shí)或雌蕊先熟記為0，雄蕊先熟記為1；（3）柱頭與花藥的空間位置，同一高度記為0，空間分離記為1。三者之和為OCI值。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為：OCI = 0 時(shí)，繁育系統(tǒng)為閉花受精；OCI = 1 時(shí)，繁育系統(tǒng)為專性自交；OCI = 2 時(shí)， 繁育系統(tǒng)為兼性自交；OCI = 3 時(shí)，繁育系統(tǒng)為自交親和，有時(shí)需要傳粉者；OCI = 4 時(shí)，繁育系統(tǒng)為異交為主，部分自交親和且需要傳粉者。測(cè)量花序直徑，記錄花藥開裂和柱頭可授性的時(shí)間、花藥和柱頭的空間距離。

按 照Cruden［16］的 標(biāo) 準(zhǔn) 進(jìn) 行 花 粉 胚 珠 比(Pollen-ovule ratio，P/O)的估算。隨機(jī)選取30 株未開放的花序，將單個(gè)花序的所有花藥放入300 μL 95%硫酸中裂解5 d(25 ℃)，取1 μL 放在載玻片上在10×顯微鏡下計(jì)數(shù)花粉數(shù)，計(jì)算平均值。每個(gè)花序的花粉量等于1 μL 中花粉數(shù)的平均值乘以300。每個(gè)花序的胚珠數(shù)等于每個(gè)子房的胚珠數(shù)乘以每個(gè)花序的子房數(shù)。

人工授粉測(cè)定掌葉半夏繁殖方式的試驗(yàn)按照表1 所示5 種方式進(jìn)行，每種方式各標(biāo)記30 個(gè)花序，授粉后20 d 左右統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)情況。

表1 人工授粉套袋試驗(yàn)的不同方式Table 1 Treatments used in the breeding system

2 結(jié)果與分析

2.1 掌葉半夏花部形態(tài)及開花物候

掌葉半夏是多年生草本單子葉植物，在半夏屬中擁有最大的塊莖和花序。其花序?yàn)槿馑牖ㄐ颍麄€(gè)花序?yàn)榫G色( 圖1 D)，花序柄長(zhǎng)201.1±34.0 mm(n=30,下同)。佛焰苞上下分為檐部和管部，無隔膜，管部長(zhǎng)圓形向下漸收縮，檐部長(zhǎng)披針形，銳尖；雌雄同株，花單性，無花被。雄花序在上，黃白色或略帶紫紅色，圓柱形，直徑3.7±0.5 mm；藥室順肉穗花序方向伸長(zhǎng)，頂孔縱向開裂，成熟花粉呈黃白色(圖1 E)。雌花序在下，與佛焰苞管部合生，雌花序直徑4.4±0.5 mm，綠白色(圖1 E)，單側(cè)著花；雌蕊柱頭呈雪白色，帽狀，子房卵圓形，1 室，1 胚珠。附屬器黃綠色細(xì)線形鼠尾狀，長(zhǎng)150.2±25.1 mm，直立或略呈“S”形彎曲，超出佛焰苞很長(zhǎng)。

掌葉半夏群體開花持續(xù)期較長(zhǎng)，從5 月到8 月陸續(xù)有花序抽出、開放散粉，就單個(gè)花序而言，佛焰苞出土后8 ～10 d 花藥開裂散粉，14 ～16 d 雄花序凋謝(15.3±0.66 d)。35 d 左右果實(shí)成熟。

根據(jù)掌葉半夏佛焰苞發(fā)育的特點(diǎn)將其劃分為8個(gè)階段見表2，對(duì)應(yīng)的發(fā)育階段見圖1。

表2 掌葉半夏佛焰苞動(dòng)態(tài)變化Table 2 Dynamic development of spathe in P. pedatisecta

圖1 掌葉半夏佛焰苞從出土到果實(shí)成熟的發(fā)育變化Fig.1 Development from spathe emergence to fruits maturity in P. pedatisecta

2.2 花粉活力測(cè)定方法的確定

通過4 種方法對(duì)掌葉半夏花粉活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TTC 法、I2-KI 法和MTT 法染色后，花粉染色效果不佳，顏色差異不明顯，無法分辨統(tǒng)計(jì)出花粉活力；采用離體萌發(fā)法，花粉離體均可以萌發(fā)，可以較準(zhǔn)確分辨統(tǒng)計(jì)花粉活力。因此，選擇離體萌發(fā)法進(jìn)行掌葉半夏花粉活力測(cè)定并研究了蔗糖和硼酸濃度對(duì)花粉萌發(fā)的影響（表3）。結(jié)果表明，蔗糖和硼酸在不同程度上對(duì)花粉萌發(fā)起作用，蔗糖硼酸組合(10%, 100 mg/L)的花粉萌發(fā)率與其它組合(5%, 100 mg/L), (10%, 250 mg/L), (15%, 100 mg/L)沒有顯著差異(P=0.01)，并且這4 組顯著高于其它12 組處理(P=0.01)，是較優(yōu)組合。然而，蔗糖硼酸組合(5%, 100 mg/L), (15%, 100 mg/L)中花粉管萌發(fā)較短，組合(10%, 250 mg/L)出現(xiàn)花粉管嚴(yán)重破裂，只有(5%, 100 mg/L)花粉管較長(zhǎng)沒有破裂且較清晰。所以最適宜硼酸濃度為100 mg/L，蔗糖濃度為10%，花粉萌發(fā)達(dá)到最大值73.56%。

表3 蔗糖、H3BO3 對(duì)花粉萌發(fā)率的影響Table 3 Effects of sucrose and H3BO3 on the germination rate

2.3 不同開花天數(shù)花粉活力檢測(cè)結(jié)果

從散粉開始每天采集掌葉半夏花粉，采用離體萌發(fā)法測(cè)定花粉活力，結(jié)果見圖2。從總體上看，不同天數(shù)的花粉活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。掌葉半夏散粉當(dāng)天花粉活力為69.64%，花粉量較少；隨著雄花序的逐漸發(fā)育，更多的花粉粒成熟，花藥散開，有活力的花粉數(shù)量增加、活力不斷增強(qiáng)，到散粉第2 天，花粉活力達(dá)到最高，為73.87%，同時(shí)花粉量最多；散粉第3 天花粉活力開始下降，第4天下降幅度較大，花粉活力僅為29.71%。因此在雜交時(shí)選擇散粉第二天的花粉授粉受精效果更好。

圖2 掌葉半夏不同時(shí)期的花粉活力Fig.2 Pollen viability of P.pedatisecta in different periods

2.4 掌葉半夏柱頭可授性檢測(cè)結(jié)果

利用聯(lián)苯胺—過氧化氫法進(jìn)行柱頭可授性的檢測(cè)結(jié)果見表4。掌葉半夏的柱頭可授性與佛焰苞的發(fā)育階段有關(guān)，事實(shí)上，在附屬器還沒伸出佛焰苞之前柱頭就已經(jīng)具有微弱的可授性（表4）。當(dāng)附屬器逐漸伸出佛焰苞，柱頭可授性也逐漸加強(qiáng)。從佛焰苞上檐打開到散粉當(dāng)天柱頭可授性最強(qiáng)，之后一直保持相對(duì)較高的可授性，到第4 天仍沒有接受到花粉則活力開始下降，至第6 天活力完全喪失。而接受花粉后第2 天柱頭活力即開始下降，第3 天則完全失去可授性。因此進(jìn)行雜交授粉時(shí)，要在柱頭具有較高可授性時(shí)授以高活力花粉，以保證良好的結(jié)實(shí)率。掌葉半夏柱頭活力檢測(cè)情況見圖3。

表4 不同時(shí)期掌葉半夏柱頭可授性Table 4 Sigma receptivity of P. pedatisecta from different stages

圖3 掌葉半夏不同時(shí)期柱頭可授性Fig.3 Sigma receptivity of P. pedatisecta in different stages

2.5 掌葉半夏的繁育系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果

花器結(jié)構(gòu)分析表明，掌葉半夏花序直徑為4.45±0.86 mm，小于6 cm，記為2；兩性花的花藥與柱頭空間有分離，花藥位置高于柱頭(1 ～1.5 mm)，記為1；柱頭在散粉前即具有可授性時(shí)，即柱頭可授期與花藥開裂時(shí)間有時(shí)間間隔，記為0。掌葉半夏OCI 值為3。掌葉半夏的繁育系統(tǒng)為自交親和，有時(shí)需要傳粉者。

掌葉半夏花粉胚珠比的檢測(cè)結(jié)果為，每個(gè)花序的花粉量為33 166.7±2 565.1 粒，胚珠數(shù)為56.7±2.2 個(gè)，因此P/O 值 為587.2±67.9。當(dāng)P/O值為244.7 ～2 588.0 時(shí)，根據(jù)Cruden 的標(biāo)準(zhǔn)，掌葉半夏屬于兼性異交。

本研究對(duì)不同授粉方式下掌葉半夏結(jié)實(shí)率進(jìn)行了估算，結(jié)果表明授粉方式不同，掌葉半夏結(jié)實(shí)率有顯著差異（圖4）。不進(jìn)行任何處理的自然授粉結(jié)實(shí)率為91.4%；去雄后直接套袋而不授予花粉時(shí)結(jié)實(shí)率為0，表明掌葉半夏不存在孤雌生殖現(xiàn)象；不去雄直接套袋進(jìn)行自花授粉結(jié)實(shí)率為80.47%，表明掌葉半夏自交親和；去雄授以異花花粉后結(jié)實(shí)率最高（92.0%），表明掌葉半夏異交親和，易于接受外來花粉完成受精過程，揭示了人工授粉有助于提高種子產(chǎn)量。而去雄后不套袋后進(jìn)行異花授粉結(jié)實(shí)率為5.48%，則表明掌葉半夏自然異交率很低，屬于常異花授粉植物。

圖4 授粉方式對(duì)掌葉半夏結(jié)實(shí)率的影響Fig.4 Fruit set ratio under five pollinating treatments for P. pedatisecta

3 討論

花序的結(jié)構(gòu)在空間和時(shí)間上強(qiáng)烈地影響著自然群體的雜交水平。無限花序比如傘狀花序，通過延長(zhǎng)花期以便獲得種群個(gè)體間更多的雜交，從而提高坐果率，獲得更多的繁衍機(jī)會(huì)［17］。如紅白忍冬為聚傘花序，單花開放時(shí)間短，但整個(gè)花序是無限生長(zhǎng)，陸續(xù)開花的習(xí)性使得植物體獲得了較多的雜交機(jī)會(huì)。因此盡管自交親和力較弱，但異花授粉結(jié)實(shí)性較好［18］。掌葉半夏花序?yàn)樘炷闲羌易逄赜械慕Y(jié)構(gòu)—佛焰花序，其特點(diǎn)也是掌葉半夏為常異花授粉植物的根本原因。首先，佛焰苞綠色，沒有豐富多彩的顏色吸引傳粉者。盡管在試驗(yàn)中觀察到了蒼蠅、螞蟻、紅蜘蛛等昆蟲，但不能確定是否具有傳粉行為。就自然異交率(5.48%)來說，他們有可能是傳粉者。當(dāng)傳粉受限時(shí)，天南星科某些植物中出現(xiàn)自花授粉來確保結(jié)實(shí)繁育后代，因此，為了確保產(chǎn)生種子，植物進(jìn)化出了自花授粉機(jī)制［19］。

另外，掌葉半夏雌花序比雄花序先成熟是一種異花授粉的機(jī)制，但實(shí)際上當(dāng)佛焰苞打開后只有雄花序露在佛焰苞外面，雌花序在佛焰苞里面，外來花粉不容易到達(dá)。此外，自花授粉概率很高，因?yàn)榛ㄋ庨_裂和柱頭具有可授性時(shí)期在時(shí)間上重疊。就人工自花授粉的自交率(80.47%)和雜交指數(shù)來說，掌葉半夏是自交親和的?；ㄋ幵谥^正上方1 ～3 mm， 花藥開裂后花粉極容易自然掉落到自身柱頭上，完成受精。綜上所述，佛焰苞結(jié)構(gòu)有助于自花授粉，盡管具有部分異交機(jī)制(雌花序先熟)。

Cruden［16］在研究80 個(gè)不同植物后得出結(jié)論，花粉胚珠比是表征繁育系統(tǒng)特征值。這樣，花粉胚珠比就作為研究植物繁育系統(tǒng)的有效工具。目前，花粉胚珠比還局限在研究雙子葉有花植物，對(duì)單子葉植物研究較少，尤其是對(duì)擁有佛焰花序的天南星科植物。天南星科有105 屬，3 300 多種植物，其繁殖機(jī)制也是多種多樣的［20-21］。

目前還尚未見有關(guān)掌葉半夏花粉胚珠比的報(bào)道。本研究不同授粉處理結(jié)果表明，掌葉半夏可以自交也可以異交，即兼性異交，與花粉胚珠比的結(jié)果一致。這表明花粉胚珠比學(xué)說可以應(yīng)用在掌葉半夏物種上。然而，Chouteau［20］在研究天南星科23 個(gè)Philodendron 屬物種和20 個(gè)Anthurium 屬物種花粉胚珠比后指出，花粉胚珠比可能與所研究的物種的繁育系統(tǒng)沒有直接的聯(lián)系，因?yàn)樘炷闲羌易逵刑厥獾膫鞣蹤C(jī)制。此外，半夏與掌葉半夏同屬，測(cè)定的花粉胚珠比為6 443±777，但是自花授粉能力尚不清楚。Mathieu 在研究天南星科54 個(gè)物種的花粉胚珠比后指出，這些物種絕大多數(shù)都沒有自花授粉能力，其花粉胚珠比變化范圍為44 ～42 2107［19］。與此不同的是，本試驗(yàn)揭示掌葉半夏有很強(qiáng)的自花授粉能力。