馬玲玉，甄一寧，羅云萍，段昭君

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系， 北京 100005)

肝纖維化是由于肝臟受到各類刺激損傷后，在肝內(nèi)發(fā)生的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)沉積與降解過(guò)程失衡的一種病理過(guò)程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)在肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。HSCs在肝纖維化中被激活，合成并分泌多種ECM成分[1]。增多的ECM積聚在肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的腔隙中，影響肝細(xì)胞與血管之間的物質(zhì)交換[2-3]。由于肝纖維化難于在早期發(fā)現(xiàn)，而一旦發(fā)現(xiàn)往往已是肝硬化階段，給治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，所以必須深入了解肝纖維化的病理變化，探索出有效的早期診斷和治療的方案。

高爾基體跨膜糖蛋白73(golgi protein 73, gp73)是高爾基體膜上的一種駐留蛋白，位于順式和中間高爾基體池中，因?yàn)槠渥畛醢l(fā)現(xiàn)時(shí)分子質(zhì)量大小為73 ku而得名[4]。該蛋白在正常的肝臟中幾乎不表達(dá)或低表達(dá)，而在病毒感染的組織和許多腫瘤中表達(dá)上調(diào)，尤其是在肝癌患者的血清中，因此血清GP73也成為了目前關(guān)注較多的一種新興腫瘤標(biāo)志物[5]。進(jìn)一步研究表明，血清GP73可以提升有肝硬化背景的肝癌患者的診斷靈敏性和特異性[6]。并且GP73在肝纖維化患者的血清中表達(dá)也升高[7-8]，但是相關(guān)的機(jī)制并不是十分明確。本研究旨在對(duì)gp73在肝纖維化過(guò)程中是否表達(dá)升高以及對(duì)升高的原因進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系：SPF級(jí)6周C57BL/6J雄鼠(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；SPF級(jí)C57BL/6-IGF2BP3floxp/floxp鼠(陸軍軍醫(yī)大學(xué)葉麗林教授饋贈(zèng))；SPF級(jí)B6.129-ROSA26tm101(CreERT2)/V鼠(Rosa26-cre/ERT2)(北京唯尚立德生物科技有限公司)；人胚腎細(xì)胞系HEK-293T(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 試劑：Sirius Red染液、Acetic acid solution(abcam公司)；GOLPH2抗體(Proteintech公司)；IGF2BP3(胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白3，insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3, IGF2BP3)抗體(Novus公司)；ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCl4誘導(dǎo)小鼠纖維化模型： 將玉米油與四氯化碳(CCl4)按照4∶1的比例稀釋，每周2次腹腔注射C57BL/6J小鼠，每只小鼠注射劑量為150 μL。6周后脫頸處死小鼠。對(duì)照組按照相同劑量注射玉米油。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)小鼠血清gp73水平： 首先按照試劑盒說(shuō)明書將檢測(cè)所用的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成7個(gè)濃度，收集的小鼠血清稀釋10倍，然后將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品加入檢測(cè)孔板中在37 ℃下溫育1 h。接下來(lái)甩干孔板，加入檢測(cè)工作液A后再次在37 ℃下溫育1 h。棄去液體后，加入洗滌液浸泡2 min，然后棄掉洗滌液甩干，重復(fù)3次后加入工作液B，于37 ℃下溫育30 min，接著重復(fù)洗滌步驟5次。最后加入底物溶液，在37 ℃下避光顯色，18 min后加入終止液。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

1.2.3 免疫組化染色： 將石蠟切片烤片后，進(jìn)行梯度脫蠟，用堿性修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，然后在樣本上滴加3% H2O2，室溫下靜置15 min以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶干擾。用羊血清室溫靜置封閉1 h后進(jìn)行抗體的孵育。然后加入DAB顯色液顯色。最后將切片脫水后封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 原代肝星狀細(xì)胞(HSCs)分離： 將麻醉后的小鼠仰臥位固定在泡沫板上，用眼科剪和鑷子剖開腹部暴露肝臟，從下腔靜脈依次灌入DMEM培養(yǎng)基和消化酶，之后剪下肝臟，輕輕研磨后放入體外消化酶中37 ℃ 消化20 min，消化完成后用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，用DMEM培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次后用4.5 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，與等體積的20%的OptiPREPTM梯度液混勻后在液面上輕輕加2 mL的DMEM培養(yǎng)基，將配好的細(xì)胞梯度液小心地在4 ℃，1 380×g條件下離心20 min。最后在9 mL處得到白色層細(xì)胞即為HSCs。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染： 在轉(zhuǎn)染前一天將合適密度的細(xì)胞鋪板。按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書稀釋質(zhì)粒，隨后將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與試劑的混合液加入細(xì)胞中，4～6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)改變： 用Trizol提取293T細(xì)胞總RNA后按照RT-PCR試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板，按照試劑盒的體系進(jìn)行PCR的相對(duì)定量檢測(cè)。引物序列(h-人源；m-鼠源)：h-GOLM1上游引物：5′-AGAGCGTCAACAAGCTGTACC-3′，h-GOLM1下游引物：5′-CAGCCTGCCGTAATTCCTCTG-3′；h-IGF2BP3上游引物：5′-AGCTGAGGAGGAGATCATGAAG-3′，h-IGF2BP3下游引物：5′-AAGGCGTTCAGATTTAAT CCAG-3′；m-GOLM1上游引物：5′-ATCTCTTGGGTCG CTTGGAC-3′，m-GOLM1下游引物：5′-GTTCCACGC TTCTCGAGCTA-3′；m-acat2上游引物：5′-CCCGTGG TCATCGTCTCAG-3′，m-acat2下游引物：5′-GGACA GGGCACCATTGAAGG-3′。

1.2.7 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)： 首先將兩組小鼠的肝組織取下，制成單細(xì)胞懸液，離心后加入事先準(zhǔn)備好的抗體溶液，放于冰上避光孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次后，最后一次用PBS重懸細(xì)胞，準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 C57小鼠肝纖維化模型的鑒定

與對(duì)照組相比，CCl4組的肝組織中有大量被染為紅色的膠原纖維，證明纖維化模型構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 Sirius Red染色鑒定構(gòu)建的纖維化小鼠模型Fig 1 Mouse model of fibrosis was identified by Sirius Red staining(×40)

2.2 肝纖維化小鼠的血清中g(shù)p73蛋白水平升高

與對(duì)照組小鼠血清中g(shù)p73水平(204±20)ng/mL相比，肝纖維化小鼠血清中的gp73蛋白水平(285±16)ng/mL明顯升高(P<0.01)(圖2)。

*P<0.01 compared with control group圖2 纖維化小鼠的血清中g(shù)p73蛋白水平升高Fig 2 gp73 protein were elevated in the serum of

2.3 肝纖維化小鼠的肝組織中g(shù)p73蛋白水平升高

與對(duì)照組相比，纖維化組的肝組織中g(shù)p73表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖3)。

2.4 肝纖維化小鼠的HSCs中GOLM1 表達(dá)升高

與對(duì)照組相比，纖維化組的HSCs中GOLM1表達(dá)水平升高(P<0.001)(圖4)。

2.5 肝纖維化小鼠的肝組織中IGF2BP3蛋白水平升高

對(duì)來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的RNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因表達(dá)的相關(guān)性分析，樣本包括肝細(xì)胞癌患者的腫瘤組織以及正常人肝組織，分析發(fā)現(xiàn)GOLM1和IGF2BP3呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)(圖5A)。兩組小鼠免疫組化結(jié)果如圖5B。陽(yáng)性的染色區(qū)域統(tǒng)計(jì)相比于對(duì)照組， 纖維化的肝組織中IGF2BP3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖5C)。

2.6 IGF2BP3過(guò)表達(dá)和敲低能影響GOLM1表達(dá)水平

A.immunohistochemistry of liver tissue; B.the statistics of the positive staining area; *P<0.05 compared with control group

*P<0.001 compared with control group圖4 C57小鼠肝纖維化模型的HSC中GOLM1 表達(dá)升高Fig 4 GOLM1 expression was elevated in hepatic stellate cells of C57 mouse hepatic fibrosis model

如圖6A，隨著IGF2BP3表達(dá)水平的升高，GOLM1的mRNA水平相較于對(duì)照組(OE Ctrl)顯著升高(P<0.001)；而在293T瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒sh1、sh2后，隨著IGF2BP3的表達(dá)水平降低，GOLM1的mRNA水平隨之降低(P<0.01)(圖6B)。

2.7 IGF2BP3基因敲除鼠肝纖維化模型的HSCs中g(shù)p73水平下降

構(gòu)建IGF2BP3基因敲除鼠(IGF2BP3floxp/floxpERT2-cre)和野生鼠(C57BL/6J)(WT)的肝纖維化模型，分離肝組織中的HSCs，然后進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)。與WT組HSCs中g(shù)p73表達(dá)(35.38±3.74)相比，gp73蛋白水平在IGF2BP3敲除組的HSCs中表達(dá)(23.64±5.48)降低(P<0.01)(圖7)。

A.IGF2BP3 was positively correlated with GOLM1； B.immunohistochemistry of liver tissue(×10); C.the statistics of the positive staining area;*P<0.05 compared with control group

A.GOLM1 expression level was increased afterIGF2BP3 was over-expressed; B.GOLM1 was down-regulated afterIGF2BP3 was knocked down;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control group

A.flow cytometry chart of HSC; B.statistical chart of HSC by flow cytometry; *P<0.01 compared with control group圖7 IGF2BP3基因敲除鼠肝纖維化的HSCs中g(shù)p73水平下降Fig 7 Protein levels of gp73 in HSCs was decreased in fibrotic IGF2BP3 knockout

3 討論

目前研究肝纖維化所用的動(dòng)物模型主要有腹腔注射CCl4誘導(dǎo)、膽管結(jié)扎手術(shù)和血清免疫法等，而其中以CCl4腹腔注射誘導(dǎo)法簡(jiǎn)單易行且穩(wěn)定可靠。本研究中即采用腹腔注射CCl4法來(lái)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，在肝纖維化成功構(gòu)建的基礎(chǔ)上，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血清中g(shù)p73的含量顯著升高，鏡下肝細(xì)胞腫脹，炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，這與臨床患者血清GP73升高以及病理改變類似，因此用此模型研究血清gp73在肝纖維化中的變化及相關(guān)機(jī)制是合適的。GP73是位于高爾基體膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，由Kladney等首次分離并鑒定[4]。本研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化后HSC內(nèi)表達(dá)gp73升高，而HSCs是肝纖維化中的關(guān)鍵細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)為接下來(lái)肝纖維化的相關(guān)機(jī)制研究提供了線索。IGF2BP3是胰島素樣生長(zhǎng)因子2信使RNA結(jié)合蛋白家族的成員之一，對(duì)多種RNA生命活動(dòng)的各個(gè)方面如合成、剪接及降解都發(fā)揮了重要作用[11]。IGF2BP3不僅可以促進(jìn)肝纖維化中的關(guān)鍵細(xì)胞HSCs向活化形式轉(zhuǎn)變，并且能夠促進(jìn)HSCs的遷移[9, 12]。本研究中發(fā)現(xiàn)纖維化肝組織中g(shù)p73和IGF2BP3水平均升高，進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IGF2BP3過(guò)表達(dá)和敲低能夠影響GP73的表達(dá)，并且在IGF2BP3敲除鼠的纖維化肝組織HSCs中g(shù)p73水平也是下降的，提示纖維化時(shí)GP73的升高表達(dá)可能受IGF2BP3調(diào)控。IGF2BP3作為RNA結(jié)合蛋白可以與mRNA結(jié)合增強(qiáng)其穩(wěn)定性[10]，由此可以進(jìn)行推測(cè)，在肝纖維化過(guò)程中升高表達(dá)的IGF2BP3通過(guò)增強(qiáng)GOLM1的穩(wěn)定性來(lái)促進(jìn)其表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn) gp73蛋白在纖維化小鼠的血清和肝組織中顯著升高，同時(shí)肝組織中的IGF2BP3水平也是升高的，并且GP73表達(dá)水平與IGF2BP3的表達(dá)水平有一定相關(guān)性。后續(xù)的工作將進(jìn)一步探索兩者之間的關(guān)系，為肝纖維化診斷、治療或預(yù)后評(píng)估提供參考。