周鴻銘，唐小牛，郭 偉，呂業(yè)超，姜玉新

(皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一種惡性消化系統(tǒng)腫瘤，是世界范圍內(nèi)最具侵襲性的惡性腫瘤之一[1]，全球每年因患胰腺癌而死亡的患者超過200萬例[2]，在中國胰腺癌位列中國城市男性惡性腫瘤發(fā)病率的第8位，居北京市和上海市人群惡性腫瘤死亡率的第5位，且每年均呈上升趨勢[3-4]，其發(fā)病隱匿、早期診斷困難、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差。5年生存率低于5%。

Opa(Neisseria gonorrhoeae opacity-associated)相互作用蛋白5(OIP5)也稱為hMis18beta[4]、LINT-2511[6]，屬于癌/睪丸抗原(cancer/testis antigens，CTA)蛋白。其編碼基因位于15號(hào)染色體。研究發(fā)現(xiàn)，OIP5與C21orf45和M18BP1形成復(fù)合物，在有絲分裂末期的著絲粒中特異性積累，對著絲粒/動(dòng)粒的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要[7]；此外，該基因通過E2F-Rb通路在細(xì)胞周期進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。這一功能是通過與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白和LAP2α(lamina-associated polypeptide 2α，板層素相關(guān)多肽2亞型α)相互作用介導(dǎo)的[8-9]?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)均說明了OIP5在細(xì)胞各個(gè)生物學(xué)進(jìn)程中的關(guān)鍵作用[10]。

OIP5異位表達(dá)已在幾種腫瘤中被鑒定。OIP5高表達(dá)與晚期腎透明細(xì)胞癌相關(guān)，且患者總生存時(shí)間縮短[11]。OIP5在結(jié)直腸癌[12]、胃癌[13]或急性髓性白血病[14]患者的腫瘤樣本中也高表達(dá)。OIP5高表達(dá)與肺癌和食管癌患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)，是預(yù)后生物標(biāo)志物和癌治療最有希望的靶標(biāo)[15]。進(jìn)一步研究觀察，OIP5上調(diào)通過mTORC2和p38/PTEN信號(hào)通路誘導(dǎo)AKT活化，并通過磷酸化β-連環(huán)蛋白和GSK-3β增強(qiáng)其核轉(zhuǎn)位來激活β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)[16]；OIP5下調(diào)通過其對mTORC1和β-連環(huán)蛋白途徑的作用抑制OIP5致癌信號(hào)傳導(dǎo)[16]。但目前尚未見OIP5在胰腺癌中的表達(dá)及其相關(guān)生物學(xué)功能的報(bào)道。因此，本研究首先分析了公共數(shù)據(jù)中關(guān)于OIP5在胰腺癌的表達(dá)情況，檢測了其在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，并構(gòu)建慢病毒敲減載體，觀察OIP5敲減對胰腺癌細(xì)胞的存活率、凋亡率以及細(xì)胞克隆形成的影響，為探討OIP5在胰腺癌中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人胰腺癌細(xì)胞系 MIAPaCa-2、PANC-1、KP-3、BxPC-3和人胚腎細(xì)胞系(HEK)293T(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。

1.1.2 主要試劑：DMEM(Gibco公司)；胎牛血清(Ausbian公司)；1%青霉素和鏈霉素溶液、Trizol試劑和4%多聚甲醛(上海生工生物股份有限公司)；?；撬帷EPES和RT-PCR Superscript Ⅱ(Invitrogen公司)；pGCSIL-GFP載體和pHelper系統(tǒng)(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司)；SYBR Master Mixture試劑盒(TaKaRa 公司)；MTT(北京鼎國生物技術(shù)公司)；二甲基亞砜(DMSO)(上海國藥集團(tuán))；Giemsa染液(Chemicon International 公司)；膜聯(lián)蛋白V-APC(eBioscience公司)。兔抗GAPDH和OIP5一抗以及HR標(biāo)記的IgG二抗(Sigma-Aldrich 公司)。其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 OIP5在臨床樣本中的表達(dá)分析：本研究通過公共在線數(shù)據(jù)庫GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)[17]分析了OIP5在胰腺癌樣本及癌旁和正常樣本中的表達(dá)，同時(shí)，分析了其總生存率和無病生存率。

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)：在DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞系，補(bǔ)充10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素溶液，3 mmol/L?；撬岷?5 mmol/L HEPES，并在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞匯合度>75%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 慢病毒載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)人OIP5基因(GenBank登錄號(hào)NM_007280)全長開放讀碼框設(shè)計(jì)特異性沉默序列；同時(shí)合成對照序列。序列如下：OIP5基因shRNA序列：5′-CTACCTCTG AAGGCTACACTT-3′，對照序列：5′-TTCTCCGAA CGTGTCACGT-3′。將帶有上述序列的莖環(huán)寡核苷酸插入pGCSIL-GFP載體，并構(gòu)建重組載體pGCSIL-shOIP5和pGCSIL-shCtrl。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行慢病毒顆粒包裝[18]。簡言之，根據(jù)試劑盒說明書，使用pHelper系統(tǒng)將pGCSIL-shOIP5/pGCSIL-shCtrl共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h收獲慢病毒。

將PANC-1細(xì)胞(5×104個(gè)/孔)接種到6孔板中，并用感染復(fù)數(shù)(MOI)為20的pGCSIL-shOIP5慢病毒或pGCSIL-shCtrl轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)孵育72 h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況。5 d 后，使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)和蛋白質(zhì)印跡測定慢病毒敲低效率。

1.2.4 RT-qPCR檢測OIP5 mRNA：使用Trizol試劑從細(xì)胞系中分離總RNA。使用2 μg總RNA，50 μmol/L Oligo(T)和1μL(200 U)RT-PCR Superscript Ⅱ在37 ℃下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄50 min。擴(kuò)增OIP5的特異性引物如下：OIP5上游引物：5′-TGGCATTGAAGGTTCA CTCA-3′；下游引物：5′-AGGGCAGCATGGGTAGAAT A-3′。使用SYBR Master Mixture試劑盒在qPCR循環(huán)儀上進(jìn)行RT-qPCR。用GAPDH作為內(nèi)參。使用Pfaffl[12]方法分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 MTT檢測法細(xì)胞增殖試驗(yàn)：處于對數(shù)期的PANC-1細(xì)胞懸液鋪到96孔板(2 000個(gè)/100 μL/孔)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后用Celigo細(xì)胞計(jì)數(shù)儀讀板，連續(xù)檢測5 d，并繪制細(xì)胞曲線。

用pGCSIL-shOIP5、pGCSIL-shCtrl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PANC-1細(xì)胞(1 000個(gè)細(xì)胞/100 μL/孔)分別接種到96孔板中，并在37 ℃和5% CO2下連續(xù)孵育5 d。隨后，向每孔中加入10 μL MTT(5 g/L)，并在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。然后，棄去上清液，向各孔中加入100 μL二甲基亞砜，并于37 ℃溫育10 min。酶標(biāo)儀測490 nm的吸光度值。

1.2.6 集落形成試驗(yàn)：將pGCSIL-shCtrl和pGCSIL-shOIP5轉(zhuǎn)染的PANC-1細(xì)胞(1 000個(gè)/孔)接種在6孔板中并孵育10 d以形成集落。每2 d更換新鮮培養(yǎng)基。隨后用PBS(pH 7.2)洗滌細(xì)胞，并用4%多聚甲醛固定30～60 min。用PBS洗滌固定的細(xì)胞，并用100 μL Giemsa染液染色20 min。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)含有>50個(gè)細(xì)胞的菌落總數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡：將PANC-1細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度培養(yǎng)到6孔板中。pGCSIL-shCtrl和pGCSIL-shOIP5慢病毒感染后5 d，收集細(xì)胞系并用冰冷的PBS(pH 7.4)洗滌。用1×染色緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1×106/mL。將100 μL細(xì)胞懸浮液用5 μL膜聯(lián)蛋白V-APC染色，并在室溫下避光孵育10～15 min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OIP5在胰腺癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

胰腺癌中OIP5 mRNA表達(dá)顯著高于正常胰腺組織(P<0.05)(圖1A)，OIP5高表達(dá)患者的總存活率顯著低于OIP5低表達(dá)患者(P<0.05)(圖1B)，且其無病生存率也顯著降低(P<0.05)(圖1C)。

2.2 胰腺癌細(xì)胞OIP5的表達(dá)

OIP5mRNA在MIAPaCa-2、PANC-1和KP-3中表達(dá)較高，而在BxPC-3細(xì)胞中的表達(dá)較低(圖2A)。Western blot也證實(shí)了OIP5蛋白在上述細(xì)胞中的表達(dá)程度(圖2B)。

2.3 慢病毒pGCSIL-shOIP5轉(zhuǎn)染對PANC-1細(xì)胞中OIP5表達(dá)的影響

慢病毒pGCSIL-shOIP5和pGCSIL-shCtrl用于感染PANC-1細(xì)胞。(圖3A)，超過80%的細(xì)胞被pGCSIL-shOIP5/pGCSIL-shCtrl慢病毒感染。為了確定pGCSIL-shOIP5慢病毒的敲低效應(yīng)，通過RT-qPCR和蛋白印跡法分析檢測了PANC-1細(xì)胞系中的OIP5表達(dá)。與pGCSIL-shCtrl慢病毒轉(zhuǎn)染組相比，在PANC-1細(xì)胞中通過pGCSIL-shOIP5慢病毒轉(zhuǎn)染顯著降低OIP5 mRNA表達(dá)(P<0.01)(圖3B)。pGCSIL-shOIP5慢病毒轉(zhuǎn)染也下調(diào)了OIP5蛋白表達(dá)(圖3C)。

A.expression of OIP5 mRNA in pancreatic cancer and normal pancreatic tissue; B.overall survival curve of OIP5 expression in patient with pancreatic cancer; C.disease free survival curve of OIP5 expression in patient with pancreatic cancer

圖1 在線分析OIP5在胰腺癌組織及正常組織中的表達(dá)及其生存分析

Fig 1 Online analysis of OIP5 expression and survival analysis in pancreatic cancer tissues and normal tissues on the GEPIA website

A.OIP5 mRNA expression in four pancreatic cancer cell lines; B.Validation of OIP5 protein expression in four pancreatic cancer cell lines圖2 OIP5在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)檢測Fig 2 Expression of OIP5 mRNA in four pancreatic

2.4 OIP5沉默對胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的影響

用pGCSIL-shCtrl慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)量在5 d內(nèi)顯著逐漸增加，而pGCSIL-shOIP5轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)量增加幅度較緩。尤其是第4天和第5天，顯著低于shCtrl組(P<0.01)(圖4A,B)。此外，MTT檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)OIP5沉默在第4天和第5天顯著抑制了PANC-1細(xì)胞的增殖(P<0.01)(圖4C)。

2.5 OIP5沉默對胰腺癌PANC-1細(xì)胞集落形成的影響

shOIP5慢病毒轉(zhuǎn)染的PANC-1細(xì)胞集落形成明顯受抑(圖5A)。經(jīng)檢測，OIP5沉默后細(xì)胞集落數(shù)(平均為9個(gè))顯著低于shCtrl對照組中的數(shù)量(平均為40個(gè))(P<0.01)(圖5B)。

A.the transfection effeciency of lentivirus vectors pGCSIL-shOIP5 and pGCSIL-shCtrl on PANC-1 cells(×100); B.effects of pGCSIL-shOIP5 knockdown on the expression of OIP5 mRNA in PANC-1 cells，*P<0.01 compared with shCtrl group; C.effects of pGCSIL-shOIP5 knockdown on the expression of OIP5 protein in PANC-1 cells

A.representative image of proliferation of PANC-1 cells(×100); B.PANC-1 cell count; C.te proliferation ratio of PANC-1 was measured by MTT;*P<0.01 compared with shCtrl group

2.6 OIP5沉默對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡的影響

如圖6A所示，OIP5沉默后PANC-1細(xì)胞凋亡比例為8.3%，明顯高于shCtrl慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(細(xì)胞凋亡比例為4.5%)(P<0.01)(圖6B)。

A.representative picture of colony formation for PANC-1 cell after transfecting relative lentiviruses(×100); B.representative images of individual colonis under light and fluorescence microscopes(×100); C.analysis of the number of clones in each well,*P<0.01 compared with shCtrl group

A.representative results of apoptotic cells analyzed by flow cytometry; B.analysis of apoptotic rate of PANCA-1 cells after shOIP5 or shCtrl knockdown,*P<0.01 compared with shCtrl group

3 討論

癌/睪丸抗原(CTA)具有免疫原性、高度的腫瘤特異性并表達(dá)于各種腫瘤中。這些特征使CTA成為腫瘤免疫療法的最有希望的候選者之一[21]。CTA根據(jù)其編碼基因的染色體定位分為兩個(gè)亞類，包括染色體X編碼的CT抗原和常染色體編碼的癌/睪丸抗原[21]。OIP5是一種常染色體編碼的CTA。研究顯示，CTA通常作為癌基因促進(jìn)腫瘤發(fā)展。OY-YES-1是人OIP5的CTAs同源物，抑制OY-YES-1的表達(dá)可降低肝細(xì)胞癌的細(xì)胞凋亡、遷移和轉(zhuǎn)移[22]。

OIP5異常表達(dá)于幾種腫瘤，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[23]、膀胱癌[24-25]、急性髓性白血病[14]、非小細(xì)胞肺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌[15]、乳腺癌[26-27]、腎透明細(xì)胞癌[11]、鼻咽癌、結(jié)直腸癌和胃癌[12]和肝細(xì)胞癌[16]。此外，OIP5表達(dá)與男性，腫瘤大小，腫瘤惡性程度和較高的T分類顯著正相關(guān)[24]。與OIP5表達(dá)較低的患者相比，具有高OIP5表達(dá)的膀胱癌患者的存活時(shí)間更短。在NSCLC和食管癌中，高度OIP5表達(dá)預(yù)示較短的患者的總體存活[15]。OIP5表達(dá)與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。在腎透明細(xì)胞癌中，OIP5上調(diào)與TNM分期和較差的預(yù)后呈正相關(guān)[4]。本研究中，基于生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)顯示OIP5在胰腺癌組織中也高度表達(dá)，且OIP5 mRNA高表達(dá)的胰腺癌患者表現(xiàn)出總生存率和無病生存率均顯著降低。

OIP5參與幾種癌類型的細(xì)胞進(jìn)展，因?yàn)樗鼘?xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡起作用。OIP5敲低抑制了膀胱癌的集落形成能力并抑制了細(xì)胞[24]。在非小細(xì)胞肺癌、食管癌和腎透明細(xì)胞癌中，OIP5下調(diào)顯著降低細(xì)胞活力和集落形成效率，而OIP5表達(dá)的恢復(fù)促進(jìn)細(xì)胞生長[11,15]。OIP5敲低也導(dǎo)致結(jié)腸直腸癌和胃癌細(xì)胞系中的細(xì)胞抑制[12]。此外，OIP5在肥胖患者的白色脂肪組織中過度表達(dá)，并促進(jìn)脂肪前體細(xì)胞和成熟細(xì)胞的增殖并導(dǎo)致脂肪增生[28]。

本研究中，RT-qPCR和Western blot檢測OIP5在多個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)結(jié)果證實(shí)，OIP5在胰腺癌細(xì)胞系中具有高表達(dá)。為了探討OIP5在胰腺癌中的作用，通過構(gòu)建慢病毒敲減載體，觀察了OIP5敲減對胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖、凋亡以及集落形成的影響，結(jié)果顯示，OIP5沉默可顯著抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖，提示OIP5可能是胰腺癌的靶向治療[26,29]。

綜上所述，OIP5在胰腺癌細(xì)胞系中具有高表達(dá)，OIP5基因可調(diào)控胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖、凋亡以及集落形成，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，提示OIP5可能在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中作為癌基因發(fā)揮作用，從而為胰腺癌的靶向治療提供了潛在的生物標(biāo)志物。