孫茂蒼，李 鑫

(聊城市第四人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 山東 聊城 252000)

惡性膠質(zhì)瘤是兒童和成人最常見、最具侵襲性的腦腫瘤，預(yù)后較差，5年生存率為10%[1]。獲得最佳的治療方案仍然是最大的挑戰(zhàn)。針對腦腫瘤分子特征的新的基因表達(dá)譜研究已經(jīng)顯示其遺傳和表觀遺傳的改變。microRNA (miRNA)為18～25 個(gè)核苷酸組成的短鏈非編碼內(nèi)源性微小的RNA分子，據(jù)報(bào)道，其參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、腫瘤細(xì)胞、增殖、凋亡以及抗癌基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的基因的功能[2]，miR-107為其中之一[3]。叉頭盒(forkhead box, FOX)基因家族是一組高度保守的轉(zhuǎn)錄因子。 越來越多的證據(jù)表明，F(xiàn)OX蛋白在腫瘤發(fā)生、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生和多種生物過程的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。如細(xì)胞增殖，代謝，免疫反應(yīng)等[4]。 叉頭盒k1(forkhead box k1, FOXK1)是FOX家族的成員[5]，其在人類多種癌癥中失調(diào)，但在膠質(zhì)瘤中的作用及與miR-107之間的關(guān)系尚未清楚。本研究擬以膠質(zhì)瘤細(xì)胞系細(xì)胞為研究對象，檢測其中miR-107和FOXK1的表達(dá)，觀察過表達(dá)miR-107、敲減FOXK1及過表達(dá)FOXK1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，以揭示其與miR-107靶向FOXK1關(guān)系，為膠質(zhì)瘤的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞系NHA、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U87、A172及U251(ATCC)DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8試劑及胰蛋白酶(Sellect公司)；RNA抽提試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；PVDF膜(Roche公司)； RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)公司)；Matrigel基質(zhì)膠及Transwell小室(Corning公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng):用含有10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)人正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87、A172、U251，待細(xì)胞增殖至匯合度75 %左右，用胰蛋白酶消化約1 min，按照1∶3的比例更換培養(yǎng)基，每2 d傳代。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與分組:將miR-NC、miR-107 mimics、si-NC、si-FOXK1、miR-107+pcDNA3.1，miR-107+pcDNA3.1-FOXK1按照脂質(zhì)體lipofectamineTM2000試劑說明書要求，轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，分別標(biāo)記為miR-NC組、miR-107 組、si-NC組、si-FOXK1組、miR-107+pcDNA3.1組，miR-107 +pcDNA3.1-FOXK1組，用RT-qPCR法檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 RT-qPCR檢測細(xì)胞中miR-107和FOXK1的表達(dá): 取適量對數(shù)增殖期1.2.2各組細(xì)胞，按miRNA抽提試劑盒說明書要求操作提取RNA，進(jìn)行定量，然后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行miR-107、FOXK1檢測。用2-△△Ct計(jì)算miR-107、FOXK1的表達(dá)。引物信息(5′-3′)：miR-107:GCC GAATTCAAAGCGAGATTCCATCAGCA,GCCGGAT CCTGTCAACCCAGAACTCAAAGG;U6:CTCGCTTC GGCAGCACA,AACGCTTCACGAATTTGCGT;FOXK1:ACACGTCTGGAGGAGACAGC,GAGAGGTTGTGCCGGA TAGA;GAPDH:TCCCTCAAGATTGCTAGCAA，AGATCC ACAACGGATACATT。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖: 調(diào)整各組細(xì)胞為105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種96孔板，37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，分別轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h加入CCK-8溶液20 μL，450 nm波長測吸光度(A450值)。計(jì)算細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖能力與細(xì)胞的A450值之比。

1.2.5 Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移和侵襲: 將 Transwell小室置于孔上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡30 min。調(diào)整細(xì)胞至5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。每個(gè)小室加入200 μL細(xì)胞懸液，即每孔細(xì)胞約為1×105個(gè)。將上室放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出上室，用棉簽擦去上室膜下表面遷移的細(xì)胞，PBS洗2次，甲醇固定30 min。自然晾干后，用1 g/L結(jié)晶紫染液染色20 min。棄染液，雙蒸水洗2次，再取出后于倒置顯微鏡下觀察拍照(400倍)，計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)不同視野的總細(xì)胞數(shù)取平均值。

將基質(zhì)膠和培養(yǎng)基按1∶8稀釋后(60 μL)鋪于小室上表面，風(fēng)干后備用，其他步驟同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞中FOXK1的蛋白表達(dá):收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。沸水浴10 min進(jìn)行變性，12 000 r/min離心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4 ℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4 ℃ 2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測miR-107與FOXK1的結(jié)合力:將FOXK1 3′UTR-WT(含F(xiàn)OXK1 3′UTR片段)和FOXK1 3′UTR-MUT(含F(xiàn)OXK1 3′UTR片段突變體)的熒光素酶報(bào)告載體，用LipofectamineTM2000分別與miR-107、miR-NC共轉(zhuǎn)染，24 h后，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒技術(shù)手冊操作，記錄螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶激發(fā)值，以兩者的比值評價(jià)FOXK1基因的激活程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-107和FOXK1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

與NHA組相比，U87、A172和U251組細(xì)胞中miR-107的表達(dá)顯著降低，F(xiàn)OXK1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)(圖1)。

2.2 過表達(dá)miR-107對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

與miR-NC組相比，miR-107組細(xì)胞中miR-107表達(dá)顯著升高，48和72 h，細(xì)胞增殖顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)(圖2)。

2.3 miR-107靶向FOXK1

用miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-107與FOXK1 3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)；與miR-NC組相比，miR-107組WT-FOXK1細(xì)胞中熒光活性顯著降低，MUT-FOXK1細(xì)胞中熒光活性不受影響(圖3B)；與miR-NC組相比，miR-107組細(xì)胞中FOXK1蛋白表達(dá)顯著降低，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-107組細(xì)胞中FOXK1蛋白表達(dá)顯著升高(圖3C)(P<0.05)。

2.4 敲減FOXK1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

與si-NC組相比，si-FOXK1組U87細(xì)胞中FOXK1蛋白表達(dá)顯著降低，48或72 h，細(xì)胞增殖顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)(圖4)。

A.expression of miR-107 in glioma cells; B.expression of FOXK1 mRNA in glioma cells; C.expression of FOXK1 protein in glioma cells；*P<0.05 compared with the NHA group

圖1 miR-107、FOXK1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)
Fig 1 Expression of miR-107 and FOXK1 in glioma cells

A.over-expression of miR-107 on the expression of miR-107 in U87 cells; B.over-expression of miR-107 on the proliferation of U87 cells; C.over-expression of miR-107 on the migration and invasion of U87 cells;*P<0.05 compared with the miR-NC group

圖2 過表達(dá)miR-107對U87細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響
Fig 2 Effect of over-expression of miR-107 on proliferation, migration and invasion of U87 cells

A.miR-107 has a binding site with the 3′UTR of FOXK1; B.effect of miR-107 on the fluorescence activity of FOXK1 cells; C.effect of miR-107 on the expression of FOXK1 protein；*P<0.05 compared with the miR-NC group；#P<0.05 compared with the anti-miR-NC group

圖3 miR-107靶向FOXK1
Fig 3 miR-107 targets FOXK1

A.knockdown of FOXK1 on the expression of FOXK1 protein in U87 cells; B.knockdown of the effect of FOXK1 on proliferation of U87 cells; C.effect of knockdown of FOXK1 on migration and invasion of U87 cells;*P<0.05 compared with the si-NC group

圖4 敲減FOXK1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響
Fig 4 Effect of knockdown of FOXK1 on proliferation, migration and invasion of glioma cells

2.5 過表達(dá)FOXK1逆轉(zhuǎn)了miR-107對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

與miR-107+pcDNA 3.1組相比，miR-107+pcDNA 3.1-FOXK1組U87細(xì)胞FOXK1蛋白表達(dá)顯著升高，48或72 h，細(xì)胞增殖顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)(圖5)。

3 討論

miRNA參與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，尤其是腫瘤，其通過與靶mRNA的3′非編碼區(qū)(untranslation region, UTR)結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，作為腫瘤抑制因子或致癌基因發(fā)揮作用[6]。miR-107在多種腫瘤中出現(xiàn)異常表達(dá)，據(jù)報(bào)道，miR-107在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞表型中具有重要的調(diào)控作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制與調(diào)控下游靶標(biāo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)[7]、Notch-2[8]、類果蠅sal4(SALL4)[9]和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)[10]有關(guān)。本研究通過RT-qPCR法檢測了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-107的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-107的表達(dá)在膠質(zhì)瘤中明顯的下調(diào)，且過表達(dá)miR-107可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這均與前人的研究結(jié)果相一致；進(jìn)一步研究，通過生物信息學(xué)預(yù)測、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)及Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-107可靶向負(fù)調(diào)控FOXK1表達(dá)。

FOXK1是FOX類轉(zhuǎn)錄因子之一，在骨肉瘤、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等多種實(shí)體腫瘤中均存在轉(zhuǎn)錄失調(diào)并發(fā)揮重要作用[11]。FOXK1在膠質(zhì)瘤中的研究甚少。FOXK1通過與基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和E-鈣黏蛋白的啟動子結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的血管生成[12]。FOXK1通過激活wnt /β-catenin信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，并且在膠質(zhì)瘤中被miR-137靶向負(fù)調(diào)控[13]。本研究檢測了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中FOXK1的mRNA和蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXK1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，敲減FOXK1可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這與已有的研究結(jié)果相一致；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)FOXK1可逆轉(zhuǎn)miR-107對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。不僅miR-107可靶向負(fù)調(diào)控FOXK1的表達(dá)，相反， FOXK1也可負(fù)向調(diào)控miR-107的表達(dá)和作用，揭示了miR-107在膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制與FOXK1之間的緊密關(guān)系。

A.over-expression of FOXK1 on the expression of FOXK1 protein in U87 cells; B.over-expression of FOXK1 on the proliferation of U87 cells; C.effect of over-expressing FOXK1 on migration and invasion of U87 cells;*P<0.05 compared with miR-107+pcDNA 3.1 group

圖5 過表達(dá)FOXK1逆轉(zhuǎn)了miR-107對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

Fig 5 Over-expression of FOXK1 reverses the inhibitory effect of miR-107 on proliferation, migration and invasion of glioma cells

綜上所述，miR-107可抑制體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與靶向FOXK1有關(guān)，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供理論依據(jù)。