楊 卉，莫顯剛，王 蘭，張?jiān)姁?/p>

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 綜合病房， 貴州 貴陽 550004)

中國冠心病患者達(dá)1 100萬，心血管病死亡率占居民全部死因的比例為 40%以上[1]。心血管疾病病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。缺氧與AS斑塊形成、發(fā)展關(guān)系密切[2-3]。神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子-1(netrin-1)在巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞滯留動(dòng)脈粥樣斑塊起重要作用[4]，影響AS的發(fā)生發(fā)展[5-6]。鈉氫交換體1( NHE1)是重要細(xì)胞膜通道蛋白，小鼠內(nèi)皮細(xì)胞缺氧條件下NHE1 mRNA及蛋白水平表達(dá)增加[7-8]，而阿米洛利(amiloride)通過阻斷NHE1活性抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減輕脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的AS斑塊形成[9]，表明NHE1激活可能是AS發(fā)生的重要事件。NHE1在netrin-1誘導(dǎo)神經(jīng)軸突早期形態(tài)發(fā)生及神經(jīng)軸突生長過程中有一定作用[10]，那在AS發(fā)生發(fā)展過程中，NHE1與netrin-1是否也存在類似相關(guān)性呢？本研究旨在探討AS斑塊病理組織水平及缺氧巨噬細(xì)胞系RAW264.7中NHE1、netrin-1表達(dá)及共定位情況，研究調(diào)控NHE1表達(dá)是否會(huì)對(duì)netrin-1表達(dá)產(chǎn)生影響。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：ApoE-/-小鼠，SPF級(jí)，6～8周齡，雄性，體質(zhì)量20 g左右[北京維通利華公司，scxk(京)2016-0006]。

1.1.2 細(xì)胞：小鼠單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系RAW264.7(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.1.3 試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素溶液、Trizol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific公司);PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE、Western blot封閉液、Western blot一抗稀釋液、Western blot二抗稀釋液和ECL發(fā)光試劑(Beyotime公司);Anti-NHE1抗體(兔源)、anti-netrin-1抗體(山羊源)和驢抗山羊熒光二抗(Abcam公司);山羊抗兔熒光二抗和蛋白Marker(CST公司);0.25%胰蛋白酶(HyClone公司);RIPA(Solarbio公司);30%丙烯酰胺(百奧萊博公司);PVDF膜(Mihipore公司);Lipofectamine?RNAiMAX(Invitroge Life Technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及處理：隨機(jī)將ApoE-/-小鼠分成標(biāo)準(zhǔn)飲食組和高脂飲組，喂養(yǎng)至12周時(shí)，麻醉處死小鼠，游離固定主動(dòng)脈弓，石蠟包埋切片(西方高脂飲食原料:酪蛋白、蛋氨酸、蔗糖、玉米淀粉、糊精等，熱量4.5千卡/g，其中脂肪42%、蛋白質(zhì)15%、碳水化合物43%、膽固醇0.2%)。

1.2.2 組織切片處理：小鼠主動(dòng)脈石蠟切片行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，用免疫熒光染色檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈NHE1、netrin-1蛋白表達(dá)及定位情況，顯微共聚焦觀察攝像并采圖。

1.2.3 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：1)設(shè)計(jì)兩條NHE1 siRNA序列，聯(lián)系相關(guān)公司生產(chǎn)，產(chǎn)品為減壓離心干燥品，低速離心10 min，使樣品沉積于管底，加入DEPC水，離心，-20 ℃保存。設(shè)計(jì)的兩組NHE1基因干擾序列：NHE1 siRNA1：正義鏈 5′-CCUGCUA CUCGUUGGUGCCUAUAAA-3′，反義鏈5′-UUUAUA GGCACCAACGAGUAGCAGG-3′；NHE1 siRNA2：正義鏈5′-GAGUGCAGAUUUCUAGCCCAUUUCA-3′，反義鏈5′-UGAAAUGGGCUAGAAAUCUGCACUC-3′；陰性對(duì)照亂碼短RNA序列：正義鏈5′-UUCUCCG AACGUGUCACGUAA-3′；反義連5′-ACGUGACACG UUCGGAGAUU-3′。2)NHE1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞：將生長至對(duì)數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞，匯合度≥70%時(shí)，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。50 μL的Opti-MEM稀釋20 pmol siRNA，50 μL Opti-MEM稀釋1 μL lipofectamine?RNAiMAX試劑，將稀釋好的siRNA和lipofectamine?RNAi MAX試劑混合，轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，6 h后去除混合液，換成無抗生素高糖DMEM培養(yǎng)液(10% FBS)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。3)干擾效率檢測(cè)：待siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞NHE1 mRNA及蛋白表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染NHE1 siRNA1組及NHE1 siRNA2組。①抽提各組細(xì)胞總RNA： PBS沖洗后加Trizol使細(xì)胞裂解后加入氯仿，混勻，使水相和有機(jī)相充分接觸，離心，管內(nèi)液體分為3層，將上層RNA移至新的RNase free管內(nèi)。加入等體積異丙醇，混勻，室溫沉淀，離心，收集RNA沉淀，棄上清，加入75%乙醇，離心，加入DEPC水，充分溶解沉淀。標(biāo)記，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫虎诳俁NA純度及完整性鑒定：ddH2O水稀釋NHE1 RNA樣品后，核酸定量儀上測(cè)定吸光度值。取NHE1 RNA樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA 3條條帶是否清晰可見，如均完整的話即可證明總RNA抽提比較完整；③反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：1 μg 總RNA，引物1 μL，DEPC水補(bǔ)足至總體積12 μL，將上述溶液混勻加入RNase free的PCR管中，離心。上機(jī)：70 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，隨后依次加樣成反應(yīng)體系(5×反應(yīng)緩沖液4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNase free PCR管中液體12 μL)。上機(jī)：50 ℃ 40 min，80 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，得到的cDNA并標(biāo)記，-20 ℃冰箱保存。NHE1引物序列：上游引物5′-CTGCCTGCTGATCG TAGTGG-3′，下游引物5′-CCCAGGAAGAACGCATT CCA-3′；GAPDH引物序列：上游引物5′-GGAGAGT GTTTCCTCGTCCC-3′，下游引物5′-ACTGTGCCGTT GAATTTGCC-3′；④PCR反應(yīng)：8連管每孔依次加入PCR反應(yīng)體系(SYBR-Green/ROX qPCR Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，DNA Template 1 μL，Nuclease-free ddH2O 7 μL)，離心數(shù)秒，上機(jī)：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR擴(kuò)增儀讀取所有樣本GAPDH和NHE1的Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算NHE1相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測(cè)Ox-LDL干預(yù)小鼠RAW264.7細(xì)胞后NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)：待細(xì)胞貼壁匯合度≥70%時(shí)，以不同濃度Ox-LDL梯度作用于RAW264.7細(xì)胞，設(shè)未加刺激的細(xì)胞為對(duì)照組；按試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白， BCA法測(cè)定蛋白濃度，樣品終濃度=測(cè)得樣品濃度(g/L)×稀釋倍數(shù)。制備SDS-PAGE凝膠(下層為10%分離膠，上層5%濃縮膠)；等量蛋白與上樣緩沖液混勻后煮沸5 min使蛋白變性后加至濃縮膠的梳齒孔中，邊緣一孔加入預(yù)染蛋白Maker 3 μL，電泳，待溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠底部邊緣1 cm時(shí)，停止電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉2 h后，使用一抗稀釋液稀釋一抗(兔抗NHE1多克隆抗體1∶1 000、山羊抗netrin-1多克隆抗體1∶1 000、兔抗GAPDH單克隆抗體1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗(山羊抗兔IgG 1∶2 000，驢抗山羊IgG 1∶2 000)，溫和振蕩孵育60 min；將PVDF膜取出發(fā)在保鮮膜上，將適量ECL滴于PVDF膜上，避光孵育1 min，紫外凝膠成像儀中進(jìn)行曝光，攝像。取最佳Ox-LDL作用濃度作用于RAW264.7細(xì)胞，分別孵育0 h(對(duì)照組)、6、12 和24 h，按時(shí)收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè)敲降NHE1后Ox-LDL對(duì)netrin-1表達(dá)的影響：在成功篩選出一條能有效抑制NHE1表達(dá)的siRNA后，繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、siRNA干擾組、Ox-LDL干擾組和siRNA+Ox-LDL干擾組。按照分組，將各干預(yù)因素分別加入細(xì)胞繼續(xù)培至24 h。Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞NHE1及netrin-1表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)脈粥樣斑塊形成

高脂飲食ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈管腔血管內(nèi)皮連續(xù)性破壞，管壁局部明顯突出于管腔內(nèi)，內(nèi)膜下可見泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)斑塊，動(dòng)脈外膜變薄，動(dòng)脈粥樣斑塊模型構(gòu)建成功(圖1)。

2.2 動(dòng)脈粥樣斑塊中NHE1表達(dá)升高

高脂飲食組ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊中NHE1陽性表達(dá)(綠色熒光)，DAPI核染也呈陽性反應(yīng)(藍(lán)色顆粒)，高脂飲食組小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊中NHE1表達(dá)升高(圖2)。

2.3 NHE1與netrin-1在斑塊中存在共表達(dá)

高脂飲食組ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊中NHE1及netrin-1均可在粥樣斑塊中表達(dá)(分別為綠色顆粒和紅色顆粒)，斑塊深部黃色區(qū)域，提示兩者存在部分共定位(圖3)。

2.4 Ox-LDL上調(diào)RAW264.7細(xì)胞NHE1、netrin-1 mRNA和蛋白表達(dá)

NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)隨Ox-LDL濃度的增加、培養(yǎng)時(shí)間的延長而上調(diào)(P<0.05)(圖4)。

2.5 轉(zhuǎn)染NHE1 siRNA后RAW264.7細(xì)胞NHE1表達(dá)下降

NHE1 siRNA1及siRNA2兩個(gè)轉(zhuǎn)染組的NHE1mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組及陰性對(duì)照組， 其中siRNA2組較siRNA1組對(duì)NHE1的干擾效率更顯著(P<0.05)(圖5A)。與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，兩組siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞NHE1蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)(圖5B)。

圖1 小鼠主動(dòng)脈組織HE染色Fig 1 Hematoxylin-eosin staining of mice aorta

圖2 小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊免疫熒光染色Fig 2 Immunofluorescence staining of atherosclerotic plaque in mice(×40)

圖3 小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊共聚焦顯微成像Fig 3 Confocal microscopic imaging of atherosclerotic plaque in mice(×40)

2.6 敲降NHE1抑制Ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞netrin-1表達(dá)

與空白對(duì)照組相比，Ox-LDL組NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05)；與空白對(duì)照組相比， siRNA2組NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)；Ox-LDL+NHE1 siRNA組與Ox-LDL組相比較，升高的NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)(圖6)。

A.different concentrations; B.different times;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with control group, 50 μg/mL, 150 μg/mL group;△P<0.05 compared with control, 6 hours, 12 hours group

圖4 不同濃度、時(shí)間Ox-LDL對(duì)細(xì)胞NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)的影響

A.RT-qPCR; B.Western blot; *P<0.05 compared with control and negative control; △P<0.05 compared with siRNA1圖5 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)RAW264.7細(xì)胞NHE1表達(dá)的影響Fig 5 Effect of siRNA on NHE1 expression in RAW264.7

*P<0.05 compared with control; △P<0.05 compared with Ox-LDL圖6 各組RWA264.7細(xì)胞NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)水平Fig 6 Expression of NHE1 and netrin-1 in RAW264.7 cells of different

3 討論

巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞遷出斑塊可促進(jìn)斑塊消退，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞出入斑塊的動(dòng)態(tài)平衡在AS斑塊形成、發(fā)展及斑塊不穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[11]。缺氧及HIF-1α升高可促使巨噬細(xì)胞脂質(zhì)合成增強(qiáng)、ATP 耗竭、乳酸堆積、增加蛋白降解和血管新生等，通過多途徑抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，并滯留于斑塊，參與AS形成與發(fā)展[12]。本研究主要探討在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化過程中，粥樣硬化斑塊病理組織水平及細(xì)胞水平下，HIF-1α靶基因產(chǎn)物NHE1、netrin-1表達(dá)情況及相互關(guān)系。

本研究在構(gòu)建AS斑塊模型成功基礎(chǔ)上，進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂飲食組小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊中NHE1陽性表達(dá)，DAPI核染也呈陽性反應(yīng)，說明高脂飲食組小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊中NHE1表達(dá)升高。這一結(jié)果與報(bào)道的[13]相類似。但是與低氧和TME(1%低氧、低血清、葡萄糖、pH和高乳酸)均能降低NHE1 mRNA表達(dá)水平的結(jié)果存在一定差異[14]。這可能是在嚴(yán)重缺氧模型中, 細(xì)胞酸性產(chǎn)物明顯增加, 產(chǎn)生H+速度超過NHE1排出H+速度，長時(shí)間嚴(yán)重缺氧導(dǎo)致升高的NHE1蛋白分子功能被抑制[15]。

新近研究發(fā)現(xiàn)netrin-1在人和小鼠AS斑塊的缺氧區(qū)域表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)研究表明Ox-LDL、缺氧或模擬缺氧以HIF-1α依賴方式上調(diào)netrin-1表達(dá)，巨噬細(xì)胞過表達(dá)具有活性HIF-1α亦上調(diào)netrin-1及受體UNC5b表達(dá)[5]。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步研究netrin-1抑制巨噬細(xì)胞遷徙的具體機(jī)制，猜測(cè)NHE1是否參與netrin-1抑制巨噬細(xì)胞遷徙途徑，從而促進(jìn)AS斑塊的發(fā)生發(fā)展？本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NHE1及netrin-1均可在粥樣斑塊中表達(dá)，且兩者存在部分共定位情況。為進(jìn)一步探討在AS細(xì)胞水平兩者是否存在一定的相互影響關(guān)系。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，給予Ox-LDL干預(yù)，可見NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)隨Ox-LDL濃度的增加而上調(diào)，且在100 g/mLOx-LDL的作用下RAW264.7細(xì)胞NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)水平最高。而在NHE1基因敲降后，可逆轉(zhuǎn)Ox-LDL作用下NHE1及netrin-1蛋白表達(dá)水平的上調(diào)。

由此可見，斑塊中缺氧巨噬細(xì)胞可同時(shí)上調(diào)netrin-1及NHE1表達(dá)，netrin-1抑制巨噬細(xì)胞遷徙，推測(cè)NHE1極可能通過某種特定機(jī)制參與或調(diào)節(jié)netrin-1這一效應(yīng)。目前，國內(nèi)外針對(duì)netrin-1及NHE1共表達(dá)及定位的研究較少，本研究會(huì)進(jìn)一步定位NHE1與netrin-1，探討兩者的表達(dá)分布特點(diǎn)及規(guī)律，以期揭示NHE1分子的重要功能位點(diǎn)在netrin-1介導(dǎo)巨噬細(xì)胞潴留中的作用及機(jī)制，豐富和發(fā)展AS斑塊缺氧生物學(xué)理論依據(jù)。