李琦玲　李豫　王志偉　顧生玖　朱開梅

摘要：以桂北金槐（Sophora japonica cv.jinhuai）為原材料進(jìn)行青霉菌（Penicillium）固態(tài)發(fā)酵，優(yōu)選出桂北金槐槐米固態(tài)發(fā)酵的最佳工藝。以槲皮素含量為因變量，采用單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗優(yōu)化發(fā)酵條件。結(jié)果表明，根據(jù)所建模型得到發(fā)酵金槐槐米的最佳工藝為溫度29.97 ℃、時間6.88 d、轉(zhuǎn)速180.86 r/min，接種量3.93 mL，槲皮素預(yù)計含量為34.81 mg/g，在此基礎(chǔ)上調(diào)整發(fā)酵參數(shù)，實際含量為33.67 mg/g，與預(yù)測值相近。證明響應(yīng)面法優(yōu)化槐米發(fā)酵工藝合理，為該藥材的開發(fā)和利用提供參考。

關(guān)鍵詞：金槐;槐米;槲皮素;青霉菌;發(fā)酵工藝;響應(yīng)面法

中圖分類號： S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0230-06

豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾習(xí)稱槐米（flos sophorae immaturus），其形狀如米粒，主要含有蕓香苷和槲皮素等10余種黃酮類化合物[1]，2015版《中國藥典》收錄的槐的藥用價值有涼血止血、清肝瀉火[2]?；睒涞脑耘嗥贩N主要有白槐、黃槐和金槐。其中，金槐是優(yōu)良的槐樹栽培品種，金槐米中蕓香苷含量高，是其他品種的1～2倍，廣西全州縣金槐米的蕓香苷含量一般為25%～28%，最高可達(dá)到40%[3-4]，而槲皮素可由蕓香苷水解而成。槲皮素是近幾年來的研究熱點，具有抗氧化、抗變形鏈球菌生物膜活性、抗過敏、抗病毒和抗腫瘤等功效[5-7]，它在醫(yī)療和制藥行業(yè)有巨大的發(fā)展空間和應(yīng)用前景，因此優(yōu)化金槐米制備槲皮素的工藝方法對臨床應(yīng)用及制藥是很有必要的。

目前，獲得槲皮素的方法主要有溶劑提取法[8]、超聲輔助提取法[9]、微波輔助提取法[10]和微生物發(fā)酵法[11-12]。微生物發(fā)酵是指在發(fā)酵過程中，利用微生物在生長代謝過程中所產(chǎn)的酶轉(zhuǎn)化中藥材中的有效成分[13]。有研究表明，槐米有效成分蕓香苷進(jìn)入腸道后，通過微生物水解成槲皮素而發(fā)揮藥效[14]。該試驗以桂北金槐米為基質(zhì)，利用青霉菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，將金槐米中蕓香苷轉(zhuǎn)化成槲皮素，通過響應(yīng)面法[15]優(yōu)化金槐米的發(fā)酵工藝，為金槐米中蕓香苷的有效利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

金槐取自廣西壯族自治區(qū)全州縣，經(jīng)廣西植物所蔣云生研究員鑒定為槐米;青霉菌由桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)院病原微生物實驗室分離篩選;槲皮素對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號100081，含量99.1%;甲醇為色譜純，水為超純水;蔡氏培養(yǎng)基購自上海博微生物科技有限公司;分析天平購自上海精天電子儀器廠;高速多功能粉碎機(jī)購自永康市鉑歐五金制品有限公司;高效液相色譜儀（島津LC-20A）購自島津企業(yè)管理有限公司;恒溫振蕩器購自韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.2 種子液的制備

將菌種接種到斜面蔡氏培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)4～6 d，加入無菌水充分刮下孢子，制備孢子懸浮液，裝入含有100 mL種子液培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，得到種子液。

1.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

將槐米干燥粉碎（過100目篩），稱取5 g槐米粉末，放入250 mL錐形瓶中，加入一定量的無機(jī)鹽蔡氏培養(yǎng)基，混合均勻，121 ℃高壓滅菌30 min。在無菌條件下，接入一定量的種子液后放于恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時間。

1.4 發(fā)酵工藝單因素試驗

發(fā)酵溫度對槲皮素含量的影響：發(fā)酵溫度24、26、28、30、32 ℃，接種量4 mL，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，時間5 d;發(fā)酵時間對槲皮素的影響：發(fā)酵時間3、5、7、9 d，接種量4 mL，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵溫度30 ℃;搖床轉(zhuǎn)速對槲皮素的影響：轉(zhuǎn)速120、160、180、200、240 r/min，接種量4 mL，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間5 d;接種量對槲皮素的影響：接種量1、4、7、10、13 mL，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間5 d，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。

1.5 槲皮素含量的測定

1.5.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速1 mL/min，檢測波長365 nm，進(jìn)樣量20 μL，流動相 ∶甲醇-水（60 ∶40）。

1.5.2 槲皮素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精準(zhǔn)稱取槲皮素對照品5 mg于50 mL容量瓶中，加色譜甲醇溶解，定容至刻度線，充分搖勻后置于4 ℃冰箱備用。精確稱量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL上述對照品溶液分別置于5 mL容量瓶中，用色譜甲醇定容。按上述色譜條件進(jìn)樣并測定峰面積。試驗結(jié)果表明，槲皮素在2～12 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：y=173.74x-106.53，r2=0.999 7。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、搖床轉(zhuǎn)速、接種量4個因素為自變量，槲皮素含量為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計原理，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面法分析試驗，因素水平設(shè)計詳見表1。采用Design Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出最佳發(fā)酵工藝，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對槲皮素含量的影響 由圖1可知，槲皮素含量受發(fā)酵溫度的影響，發(fā)酵溫度為30 ℃ 時槲皮素含量最高，再繼續(xù)升高溫度，槲皮素含量下降。溫度過低時會減緩青霉菌的生長代謝，導(dǎo)致槲皮素含量較低;溫度升高時也會抑制菌體的生長或滅活。因此選擇30 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.1.2 發(fā)酵時間對槲皮素含量的影響 由圖2可知，發(fā)酵時間為3～7 d時，槲皮素含量隨著發(fā)酵時間的延長而增加，發(fā)酵溫度在7 d時，槲皮素含量達(dá)到最大;隨著發(fā)酵時間再度增加，槲皮素含量略微下降。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵時間過長，菌利用產(chǎn)物進(jìn)行生長繁殖，導(dǎo)致槲皮素含量的減少。因此選擇7 d為最佳發(fā)酵時間。

2.1.3 搖床轉(zhuǎn)速對槲皮素含量的影響 由圖3可知，槲皮素含量隨轉(zhuǎn)速升高而逐漸增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到180 r/min時，槲皮素含量最高;當(dāng)轉(zhuǎn)速再升高時，槲皮素含量下降并趨于平緩。轉(zhuǎn)速增加時溶氧量也相應(yīng)增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到最佳值時，溶氧量也達(dá)到上限，轉(zhuǎn)速再繼續(xù)增加不會增加溶氧量[16]，因此選擇最佳搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.1.4 接種量對槲皮素含量的影響 由圖4可知，接種量為1～4 mL時，槲皮素含量隨著接種量的增加而逐漸增加，接種量為4 mL時， 槲皮素含量達(dá)到最大;接種量繼續(xù)增加時，槲皮素含量下降。接種量的多少可以影響菌的生長繁殖速度，接種量過多時，菌體繁殖過快，導(dǎo)致菌體生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)不夠而利用槲皮素作為其營養(yǎng)物質(zhì)的來源，降低了槲皮素含量[17]。因此選擇4 mL為最佳接種量。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以發(fā)酵溫度、時間、轉(zhuǎn)速、接種量作為主要因素，根據(jù)BOX-Behnken Design設(shè)計原理，試驗設(shè)計和試驗結(jié)果詳見表2。

利用Design-Expert 8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次元回歸分析，可得出影響因素的關(guān)聯(lián)方程，多元回歸擬合分析得到模型的擬合方程為Y=34.75-0.48A-0.12B-1.05C+0.63D-0.74AB-0.21AC+1.78AD-0.17BC-2.68BD-0.78CD-8.12A2-7.43B2-8.98C2-7.80D2。

由表3可知，回歸方程顯著（P模型<0.000 1），失擬項不顯著（P>0.05），表明試驗?zāi)Ｐ椭械亩検椒匠梯^符合實際發(fā)酵情況，較好地反映了發(fā)酵溫度、時間、轉(zhuǎn)速、接種量對槲皮素含量的交互作用具有高度顯著影響。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 由圖5可知，固定發(fā)酵時間5 d，轉(zhuǎn)速160 r/min， 當(dāng)發(fā)酵溫度不變時，槲皮素含量隨著接種量的增加先增加后減少;當(dāng)接種量不變時，槲皮素的含量隨著發(fā)酵溫度的升高先增加后減少;在發(fā)酵溫度和接種量處于中間水平時槲皮素含量達(dá)到最大值。

由圖6可知，固定發(fā)酵溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速160 r/min，當(dāng)發(fā)酵時間不變時，槲皮素含量隨著接種量的增加先增加后減少;當(dāng)接種量不變時，槲皮素含量隨著發(fā)酵時間的延長先增加后減少;在發(fā)酵時間和接種量處于中間水平時槲皮素含量達(dá)到最大值。

由圖7可知，固定發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間5 d，當(dāng)轉(zhuǎn)速不變時，槲皮素含量隨著接種量的增加先增加后減少;當(dāng)接種量不變時，槲皮素含量隨著轉(zhuǎn)速的增大先增加后減少;在接種量和轉(zhuǎn)速處于中間水平時槲皮素含量達(dá)到最大值。

由圖8可知，固定接種量4 mL，轉(zhuǎn)速160 r/min當(dāng)發(fā)酵溫度不變時，槲皮素含量隨著發(fā)酵溫度的升高先增加后減少;當(dāng)發(fā)酵溫度不變時，槲皮素含量隨著發(fā)酵時間的延長先增加后減少;在發(fā)酵時間和溫度處于中間水平時槲皮素含量達(dá)到最大值。

由圖9可知，固定發(fā)酵時間5 d，接種量4 mL當(dāng)發(fā)酵溫度不變時，槲皮素含量隨著轉(zhuǎn)速的增大先增加后減少;當(dāng)轉(zhuǎn)速不變時，槲皮素含量隨著發(fā)酵溫度的升高先增加后減少;在轉(zhuǎn)速和發(fā)酵溫度處于中間水平時槲皮素含量達(dá)到最大值。

由圖10可知，固定發(fā)酵溫度30 ℃，接種量4 mL 當(dāng)發(fā)酵時間不變時，槲皮素含量隨著轉(zhuǎn)速的增大先增加后減少;當(dāng)轉(zhuǎn)速不變時，槲皮素含量隨著發(fā)酵時間的延長先增加后減少;在轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時間處于中間水平時槲皮素含量達(dá)到最大值。

2.3 驗證試驗

根據(jù)Box-Behnken優(yōu)化試驗和回歸模型分析，得出金槐槐米最佳發(fā)酵條件為接種量3.93 mL、發(fā)酵溫度29.97 ℃、發(fā)酵時間6.88 d、轉(zhuǎn)速180.85 r/min，[CM（15*2/3]在此優(yōu)化條件下槲皮素含量預(yù)計為4.81 mg/g?？紤]到實際操作，為了便于試驗，在此基礎(chǔ)上調(diào)整發(fā)酵參數(shù)，確定最佳發(fā)酵工藝條件為接種量4 mL、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間7 d、轉(zhuǎn)速180 r/min，重復(fù)3組平行試驗，得到槲皮素含量為33.67 mg/g，與預(yù)測值接近，證明了優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵桂北金槐槐米工藝條件的準(zhǔn)確性和可靠性。

3 討論

現(xiàn)行的槲皮素生產(chǎn)一般采用的是化學(xué)二步法工藝，而微生物發(fā)酵能將金槐米中的蕓香苷直接轉(zhuǎn)成槲皮素，且固態(tài)發(fā)酵對設(shè)備要求低、耗能低、污染小;發(fā)酵產(chǎn)物無需復(fù)雜的提取分離過程，這對進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本和環(huán)境污染具有實際的利用價值。微生物發(fā)酵是一個極其復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，在發(fā)酵工業(yè)中，其生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種的自身性能，還和發(fā)酵條件等外界環(huán)境有關(guān)，因此發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對發(fā)酵水平的提高起著舉足輕重的作用[18-19]。為了獲得最佳發(fā)酵工藝，本試驗采用響應(yīng)面法，與傳統(tǒng)優(yōu)化方法相比，響應(yīng)面法能通過直觀、精準(zhǔn)度較高的數(shù)學(xué)模型對最佳工藝進(jìn)行優(yōu)化，將因素和結(jié)果的關(guān)系進(jìn)行多項式擬合，優(yōu)化出最佳青霉菌固態(tài)發(fā)酵金槐米轉(zhuǎn)化槲皮素的發(fā)酵工藝，最佳發(fā)酵工藝為接種量4 mL、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間7 d、轉(zhuǎn)速180 r/min，此條件下槲皮素含量為33.67 mg/g。該試驗建立的數(shù)學(xué)模型可靠、合理，提高了工作效率，而且為進(jìn)一步開發(fā)金槐中的蕓香苷轉(zhuǎn)化槲皮素提供了參考。

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