滕天明，黃進勇，薛雨辰，黃龍飛，楊 清，孫躍民

(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，天津 300052)

近年來射血分數(shù)保留型心力衰竭(heart failure with preserved left ventricular ejection fraction, HFpEF)的患病率在逐漸增加，年死亡率約為22.2%，其發(fā)病機制仍不明確，目前尚無有效的治療方案能夠完全逆轉(zhuǎn)HFpEF的自然病程[1]。目前有研究認為，左心室舒張功能障礙(LVDD)引發(fā)的心肌細胞內(nèi)一系列病理生理改變可能是HFpEF細胞內(nèi)源性發(fā)病機制之一。大量研究表明鋅(Zinc，Zn)及鋅轉(zhuǎn)運體(Zinc transporter)與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，鋅轉(zhuǎn)運體包含ZnT和Zip兩大家族，目前已經(jīng)確定了10種ZnT和14種Zip鋅轉(zhuǎn)運體。本課題組前期研究中不僅發(fā)現(xiàn)鋅轉(zhuǎn)運體Zip2在心肌缺血再灌注小鼠心肌中表達明顯上調(diào)，并通過調(diào)節(jié)STAT3發(fā)揮心肌保護作用[2]，而且還發(fā)現(xiàn)HEpEF大鼠心肌組織中Zip 14的mRNA和蛋白表達水平亦明顯增高。目前尚無研究報道Zip13在LVDD心肌重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中的病理生理學作用，因此本文擬采用Dah1鹽敏感大鼠制備LVDD模型，探討鋅轉(zhuǎn)運體Zip13在LVDD大鼠心肌組織的表達變化及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 Dah1鹽敏感性大鼠(Dah1 salt-sensitive rat，DSS)，雄性，5周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001。大鼠在環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度45%～55%，12 h/12 h光照周期，SPF屏障環(huán)境飼養(yǎng)盒內(nèi)適應性飼養(yǎng)1周。

1.2主要試劑和儀器 Zip13兔多克隆抗體(BIORBYT, UK)，GAPDH抗體(Cell Signaling Technology，America)，HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗(Sigma，America)。化學發(fā)光法檢測試劑盒(Millipore，America)；總RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(Invitrogen，America)。所用引物均由美國Invitrogen公司合成。其余生化試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器包括CFX 96 Real-Time system(Bio-Rad，America)，電感耦合等離子光譜儀(ICP，PerKinElmer，America)，小動物超聲儀(Vevo 2100 Imaging System，Canada)，尾套式智能無創(chuàng)血壓儀(BP-2010 AUL Softron，Japan)等。

1.3主要方法

1.3.1動物模型的制備及標本采集 將36只DSS大鼠隨機分為模型組(n=22)和對照組(n=14)。模型組和對照組飼料中氯化鈉含量分別為8%和0.3%，其他組分含量完全相同(鋅的含量均為30 mg/kg)。造模期內(nèi)，每日記錄體重、呼吸頻度、毛色、反應和活動度等體征變化；每兩周使用尾套式智能無創(chuàng)血壓儀測量并記錄心率和血壓；分別于造模后第6周、12周和19周，采用小動物超聲儀檢測大鼠心功能相關(guān)指標：室間隔舒張末期厚度(IVSd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、舒張末左心室后壁厚度(LVPWd)、收縮末左心室后壁厚度(LVPWs)、左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心室質(zhì)量(LVM)、Weight和LVM/Weight。經(jīng)各項指標證實模型制備成功后，收集各組大鼠血清，分離出左心室分裝后儲存于-80℃冰箱，用于提取蛋白、RNA及檢測Zn離子濃度。

1.3.2實時定量熒光PCR(RT-qPCR)檢測大鼠心肌組織Zip13 mRNA表達 Trizol法提取心肌組織總RNA。NanoDrop 2000 C 分光光度法測定總RNA濃度，經(jīng)RNA甲醛變性電泳檢測其完整性，然后行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按照Real-Time PCR試劑盒說明書的標準操作步驟行PCR，GAPDH作為內(nèi)參照，擴增條件為95 ℃ 1 min，(95 ℃ 15 s、Tx ℃ 30 s、72 ℃ 15 s)35個循環(huán)，72 ℃ 1 min。引物設計采用Primer 5.0軟件設計，經(jīng)Blast進行同源性比較，由Invitrogen公司合成(表1)，運用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達水平。

表1 實時定量RT-PCR引物序列

1.3.3Western Blot法檢測大鼠心肌組織Zip13蛋白的表達 用RIPA提取各組大鼠心肌組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量，取30 μg蛋白樣品，加入2×上樣緩沖液，煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶溶液室溫封閉90 min后，Zip 13抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3次，每次10 min，孵兔抗大鼠二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌4 次，每次15 min，ECL顯影，GAPDH為內(nèi)參，使用Image Lab軟件對其進行數(shù)據(jù)分析處理。

1.3.4電感耦合等離子發(fā)射光譜法(ICP-OES)測定鋅離子濃度 65%的濃硝酸進行心肌組織消解，配置標準品，標準曲線擬合度需達到0.9999以上，各組大鼠血清500 μl及1 ml超純水加入到2 ml EP管中，使用電感耦合等離子光譜儀檢測并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.5超聲心動圖檢查 采用Vevo 2100 Imaging System小動物超聲儀MS400探頭(探頭頻率為30 MHz)行超聲心動圖檢查，全部操作由培訓的專業(yè)人員按照標準操作規(guī)程完成。分別在第6周、12周和19周，將兩組大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，胸前備皮、仰臥位固定，B-Mode獲取左心室長軸切面，M型超聲取樣線置于乳頭肌處，垂直于室間隔及左心室后壁，經(jīng)M型超聲曲線測量。獲取指標主要包括： IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVIDd和LVIDs。計算LVEF、LVM和LVM/Weight。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠基本情況 造模過程中，模型組共有5只大鼠死亡，對照組無死亡。與對照組比較，第19周時，經(jīng)兩名臨床醫(yī)師獨立判定，模型組大鼠大部分表現(xiàn)為豎毛且毛色光澤度差，活動度下降，經(jīng)常性閉目、反應不敏感，個別還出現(xiàn)呼吸頻度明顯加快等表現(xiàn)。

2.2兩組大鼠血壓、心率的變化 與對照組相比，模型組平均收縮壓和舒張壓差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而平均心率差異無統(tǒng)計學意義。不同時間點間的平均收縮壓、舒張壓和心率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；時間與處理因素的交互作用下平均收縮壓差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而平均舒張壓和心率差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)血壓升高，尤其收縮壓升高明顯，見表2。

表2 兩組大鼠血壓和心率比較

注：1 mmHg=0.133 kPa

2.3兩組大鼠超聲心動指標的變化 第6周時，模型組大鼠的LVDd、LVDs、IVSd、LVPWd、LVPWs、LVEF、LVM、Weight及LVM/Weight差異無統(tǒng)計學意義；第12周時，模型組大鼠LVPWs、Weight及LVM/Weight明顯增高(P<0.05)；第19周時，模型組大鼠LVDd、IVSd、LVPWd、LVPWs、LVM及LVM/Weight明顯增高(P<0.05)，而Weight明顯降低(P<0.05)，LVDs及LVEF差異仍無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組和對照組大鼠第19周的LVDd、LVDs、IVSd、LVPWd、LVPWs、LVM、和Weight值均高于第6周，而LVM/Weight和LVEF均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。時間與處理因素的交互作用差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果表明第12周時，模型組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)明顯不對稱室壁增厚，尤其是LVPWd、LVPWs和LVM/Weight明顯升高，進行性左心室舒張功能不全和心肌肥厚的征象已經(jīng)開始顯現(xiàn)。到第19周時，伴隨模型組大鼠普遍意義的心肌尺徑增厚，開始呈現(xiàn)收縮功能正常而舒張功能受損，左心室重構(gòu)性肥厚明顯，即出現(xiàn)明顯的LVDD超聲表現(xiàn)。見圖1。

2.4兩組大鼠血清和心肌組織中鋅離子濃度濃度的變化 ICP-OES檢測結(jié)果表明，與對照組相比，模型組大鼠心肌組織中的鋅含量顯著增加，而血清中鋅離子濃度則明顯降低，見圖2。

2.5兩組大鼠心肌組織中Zip13 mRNA和蛋白的表達變化 與對照組相比，模型組心肌組織Zip13 mRNA的表達水平明顯增高，而且與其對應的Zip13蛋白表達水平亦顯著升高(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

近年來，細胞和分子水平的探索成為心力衰竭研究領域的熱點[3]。鋅維持細胞正常生理功能及發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導作用的前提是鋅穩(wěn)態(tài)[4]。鋅穩(wěn)態(tài)是指鋅在機體內(nèi)的濃度和分布處于相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡，該動態(tài)平衡被打破即鋅穩(wěn)態(tài)失衡。鋅穩(wěn)態(tài)失衡與多種心血管疾病包括缺血再灌注損傷有關(guān)[5]。鋅的動態(tài)活性及其作為信號傳遞介質(zhì)的作用是目前研究的熱點。盡管鋅離子本身具有氧化還原惰性，但是其對氧化還原狀態(tài)的變化很敏感[6]。有研究顯示，機體處于氧化應激狀態(tài)下，鋅會從細胞內(nèi)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等結(jié)合位點加速釋放，有可能導致細胞內(nèi)鋅富集。這種鋅聚集有可能潛在影響線粒體代謝，從而反饋性影響細胞的氧化還原狀態(tài)。這些作用有可能是通過影響信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)的[7]。

我們推測本研究觀察到的鋅胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的原因之一是心肌需鋅量增加，這很可能涉及和包括一些研究者定義的細胞內(nèi)早期和晚期鋅信號。早期鋅信號快速且短暫，沒有鋅轉(zhuǎn)運體的參與，不會對細胞內(nèi)鋅的濃度和分布造成本質(zhì)改變即基本不會改變鋅穩(wěn)態(tài)[8]。晚期鋅信號的作用則緩慢且持久，持續(xù)超過數(shù)小時的鋅刺激才有可能引起細胞內(nèi)鋅濃度和分布的絕對變化，且主要是需要能量和復雜啟動機制的鋅轉(zhuǎn)運體協(xié)助下鋅的跨膜主動轉(zhuǎn)運引起的，通常對細胞內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)起決定作用[9]。本研究推測，LVDD心肌細胞內(nèi)鋅濃度可能先后經(jīng)歷了以上兩個過程，且鋅轉(zhuǎn)運體Zip13可能參與了一系列復雜晚期鋅信號的調(diào)控。

本研究中，兩組大鼠均為正常鋅飲食，飼料中鋅的含量均為30 mg/kg。在沒有額外的外源性鋅攝取和補充的情況下，推測LVDD大鼠心肌細胞鋅濃度升高的原因很有可能是某種機制促使細胞從血漿中以一定途徑向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)入了更多的鋅。但也有研究認為，可能是機體外排鋅的增加導致了細胞外鋅濃度降低[10]。本研究認為尚不能完全確定LVDD大鼠血清中鋅離子轉(zhuǎn)移的方向，但我們的發(fā)現(xiàn)與以上兩種觀點并不矛盾。因為啟動和調(diào)控機制的不同，以上關(guān)于鋅轉(zhuǎn)移的方向和途徑很有可能是同時存在的。

以往研究顯示，Zip13所屬的Zip家族的作用是主動將細胞器或細胞外的鋅離子向胞內(nèi)釋放或轉(zhuǎn)運以增加細胞內(nèi)鋅離子濃度[11]。我們推測，LVDD心肌細胞處于壓力誘發(fā)的應激狀態(tài)，細胞內(nèi)存在鋅穩(wěn)態(tài)失衡，通過某種途調(diào)控鋅離子由心肌細胞外轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)的晚期鋅信號發(fā)揮了抗氧化應激、抗炎的心肌保護作用，Zip13很可能參與了該過程并發(fā)揮了重要的載體和媒介作用[12-13]。Zip13與鋅濃度升高即穩(wěn)態(tài)失衡二者之間明確的因果關(guān)系和相互作用還存在很大爭議，有待進一步闡明。STAT3信號通路和核因子(NF)-κB信號通路可能與具體的作用機制有關(guān)[14-15]。截至目前，至少有兩種觀點是存在的。第一種觀點認為鋅本身作為一種信號分子，心肌鋅濃度的改變作為原因在先，Zip13感受鋅信號后被動調(diào)控鋅濃度[16-18]。第二種觀點則認為Zip13表達增加可能是LVDD心肌病生理改變的適應性變化，即心肌細胞自身適應性調(diào)整。甚至有研究者認為，鋅可能與Zip13無直接關(guān)系，即使二者有關(guān)，鋅也并不是唯一導致Zip13表達增加的始動因素[19-22]。本研究結(jié)果更傾向于第一種觀點。

本研究有一定局限性，從以下幾個方面改進和完善是必要的：首先，增加外源性鋅干預，如不同濃度梯度的外源性補鋅和缺鋅干預，以確證鋅的作用；其次，增加對機體不同組織或細胞不同區(qū)域鋅分布的檢測，特別是增加機體外排鋅的檢測；最后，增加對Zip13本身的直接干預包括基因敲除等手段等，以明確鋅與Zip13的相互關(guān)系和具體調(diào)控機制。同時，有必要將其他鋅轉(zhuǎn)運體一并納入研究和篩選范圍。通過以上改進和完善，以期明確LVDD中鋅與Zip13的具體作用機制。