周瑞，劉妍如，王征，張軍武，李宏， 許洪波，何姬，張玉茹，唐志書*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/ 秦藥特色資源研究與開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 制藥廠/陜西省博士后創(chuàng)新基地，陜西 咸陽 712046

2019年12月開始，在我國湖北武漢及周邊城市發(fā)生了新型冠狀病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)引起的急性肺炎。此次引起流行的病毒與2003年的SARS病毒相似，都屬于冠狀病毒科的β屬冠狀病毒，傳播快，人群普遍易感[1-2]。新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)輕度患者出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、干咳等癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)呼吸困難、呼吸窘迫綜合征或膿毒癥休克等癥[3]。采用中西醫(yī)結(jié)合對(duì)癥治療已取得滿意的療效，特別是在減少輕癥轉(zhuǎn)化為重癥，減少重癥，病死率方面體現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢(shì)[5-6]。

中醫(yī)認(rèn)為病毒導(dǎo)致的傳染病屬于“瘟疫”的范疇，中醫(yī)藥在我國治療各種疾病已有千年歷史，《溫病條辨》《傷寒論》《黃帝內(nèi)經(jīng)》等中醫(yī)典籍中也記載了大量對(duì)這類疾病的診療方法和處方。中醫(yī)認(rèn)為新型冠狀病毒的病因?yàn)楦惺芤哽逯畾鈁7]，病位在肺，基本病機(jī)特點(diǎn)為“濕、熱、毒、瘀”。在防控緊迫的局勢(shì)下，從臨床現(xiàn)有療效確切的抗炎抗病毒中藥方劑中，尋找可以有效防治COVID-19的藥物是更快速、更安全、更有效的策略。消炎退熱合劑是陜西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠生產(chǎn)的1種中藥復(fù)方制劑，臨床針對(duì)病毒性感冒發(fā)熱、咳嗽等癥具有顯著療效。該復(fù)方由大青葉、蒲公英、紫花地丁、甘草4味中藥組成。方中君藥為大青葉和蒲公英，臣藥為紫花地丁，佐以甘草解毒調(diào)和諸藥，共同發(fā)揮清熱解毒之功效[8-11]，其中大青葉、甘草和蒲公英在全國防治COVID-19的中藥方劑中出現(xiàn)頻次較高[12]。消炎退熱合劑全方重在圍繞熱毒而設(shè)，非常切合目前COVID-19的中醫(yī)病機(jī)。因此，本研究推測(cè)該復(fù)方可能通過抑制病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)免疫，有效地阻斷病毒感染引起的炎癥風(fēng)暴等，實(shí)現(xiàn)防治COVID-19。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理和分子對(duì)接方法對(duì)于研究闡明中藥多成分、多靶點(diǎn)整體治療疾病的機(jī)制提供了很好的技術(shù)[13-15]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出消炎退熱合劑的作用靶點(diǎn)，并進(jìn)行聚類分析，預(yù)測(cè)消炎退熱合劑中具有抗病毒作用的核心活性化合物，進(jìn)而運(yùn)用分析軟件對(duì)藥材-化合物-靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接以及信號(hào)通路分析，并預(yù)測(cè)其治療COVID-19的作用機(jī)制，為消炎退熱合劑用于治療COVID-19提供理論參考。

1 方法

1.1 化學(xué)成分收集及篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)(http：//tcmspw.com/)和Pubchem有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索，以“大青葉Isatidis Folium”“蒲公英Taraxaci Herba”“紫花地丁Violae Herba”“甘草Glycyrrhizae Radix et Rhizoma”為關(guān)鍵詞檢索消炎退熱合劑的化學(xué)成分。進(jìn)一步以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%或類藥性(Drug Likeness，DL)≥ 0.18作為條件，對(duì)化合物進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

1.2 “化合物-疾病靶點(diǎn)”篩選

從TCMSP和Pubchem數(shù)據(jù)庫中搜索化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，以UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/uniprot/)對(duì)收集的靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化和校正，得到成分相關(guān)的基因靶點(diǎn)。在MalaCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.malacards. org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Targets Database，http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)和OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)中輸入關(guān)鍵詞“Severe Acute Respiratory Syndrome”“Respiratory Failure”，搜索已報(bào)道的與冠狀病毒感染肺炎和重癥呼吸道疾病相關(guān)的基因。剔除重復(fù)和假陽性基因后，整理得到與冠狀病毒感染肺炎相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

1.3 “成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述得到的化合物相關(guān)靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)以Venn工具(2.1.0，https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取靶點(diǎn)交集。將交集內(nèi)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，以人類(Homosapiens)為種屬，查詢蛋白相互作用信息，從而構(gòu)建PPI(Protein to Protein Interaction)網(wǎng)絡(luò)。整合PPI網(wǎng)絡(luò)的蛋白互作信息，“成分-疾病-靶點(diǎn)”及“中藥-成分”信息，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2(http：//www.cytoscape.org/)軟件，構(gòu)建“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)”預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)。以網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)和邊線來描述化合物與中藥、疾病和靶點(diǎn)之間的關(guān)系，以Cytoscape的Network analysis插件分析并提取網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)和邊的特征。

1.4 生物過程注釋及靶點(diǎn)的通路分析

為了分析消炎退熱合劑的作用機(jī)制，采用R軟件包(3.6.2)的Cluster profiler包對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO (Gene Ontology)生物信息學(xué)富集分析，用3個(gè)本體(Ontology)來描述基因靶點(diǎn)的分子功能(Molecular Function，MF)、所處的細(xì)胞位置(Cellular Component，CC)和參與的生物過程(Biological Process，BP)。然后以KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https：//www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)基因參與的主要生化代謝途徑進(jìn)行富集和注釋，顯著性差異設(shè)定卡值為P<0.05，以R軟件包(3.6.2)的ggplot2包進(jìn)行繪圖。最終整合冠狀病毒感染肺炎的病理學(xué)、分子生物學(xué)機(jī)制研究，對(duì)消炎退熱合劑的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同抗病毒感染肺炎機(jī)制進(jìn)行闡釋。

1.5 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

采用ChemOffice軟件構(gòu)建化合物的3D結(jié)構(gòu)，保存為*mol2格式并使其能量最小化。從PDB數(shù)據(jù)(https：//www.rcsb.org/)下載ACE2蛋白質(zhì)(PDBID：2ajf)的3D結(jié)構(gòu)*PDB格式，采用LibDock分子對(duì)接方法，其打分函數(shù)LibDockScore>100即表明受體與配體能較好地結(jié)合，其值越大則表明對(duì)接產(chǎn)生的復(fù)合物構(gòu)象越穩(wěn)定，配體與受體的親和作用越好。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

結(jié)合前期發(fā)表的消炎退熱合劑成分鑒定結(jié)果與TCMSP數(shù)據(jù)庫收載的組方中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)，基于樣本量、后續(xù)數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜性以及研究?jī)r(jià)值的考慮，以O(shè)B≥30%或DL≥0.18作為進(jìn)一步篩選條件，得到符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的活性化合物117個(gè)。

2.2 化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

通過TCMSP平臺(tái)和Pubchem數(shù)據(jù)庫中找到消炎退熱合劑化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共498個(gè)，以Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索校正后生成“成分-靶點(diǎn)”集合。從MalaCards數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫中得到關(guān)于冠狀病毒“Severe Acute Respiratory Syndrome”和“Respiratory Failure”相關(guān)的靶點(diǎn)共計(jì)144個(gè)，生成“疾病-靶點(diǎn)”集合。將上述得到的“成分-靶點(diǎn)”和“疾病-靶點(diǎn)”集合以Venn工具 2.1.0取靶點(diǎn)交集，得到交集靶點(diǎn)27個(gè)(見圖1A)。將交集內(nèi)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0，構(gòu)建PPI(Protein to Protein Interaction)網(wǎng)絡(luò)(見圖1B)。

2.3 “成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將篩選得到的27個(gè)靶點(diǎn)與4個(gè)中藥進(jìn)行映射，篩選出18個(gè)核心化合物。來自大青葉的4個(gè)，蒲公英的1個(gè)，紫花地丁的7個(gè)，甘草的6個(gè)。將中藥、歸經(jīng)及18個(gè)核心化學(xué)成分進(jìn)行映射并生成關(guān)聯(lián)表，與PPI網(wǎng)絡(luò)生成的互作表導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建消炎退熱合劑的“中藥-化合物-靶點(diǎn)”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)(見圖2)。

注：A. 消炎退熱合劑中化學(xué)成分靶點(diǎn)與疾病網(wǎng)絡(luò)交集；B. PPI網(wǎng)絡(luò)。圖1 消炎退熱合劑“化合物-疾病”靶點(diǎn)相互作用分析

注：藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表歸經(jīng)；橘黃色節(jié)點(diǎn)代表中藥；綠色節(jié)點(diǎn)代表活性成分；紫粉色節(jié)點(diǎn)代表疾病靶點(diǎn)。圖2 消炎退熱合劑中“中藥-歸經(jīng)-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建中藥-歸經(jīng)-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，圖中總共涉及125個(gè)節(jié)點(diǎn)，706個(gè)邊。不同顏色的圓點(diǎn)代表了消炎退熱合劑中中藥-歸經(jīng)-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。圖中節(jié)點(diǎn)大小代表度數(shù)大小，度數(shù)越大，說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要，接近中心度越大，說明節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越接近中性。分析4種中藥在網(wǎng)絡(luò)圖的連接度值可知，君藥大青葉度值最高為162，其次是蒲公英和甘草度值為72，紫花地丁度值為48。根據(jù)組成藥物的歸經(jīng)信息分析，可以看到，網(wǎng)絡(luò)中連接度最大的是胃和心2個(gè)節(jié)點(diǎn)，連接度分別是45和41，其次是肝的連接度值為20，脾和肺的連接度值均是6。此結(jié)果表明消炎退熱合劑主要?dú)w于胃和心，其次是肝、脾、肺。分析化學(xué)成分的連接度值，發(fā)現(xiàn)大青葉中的核心化合物靛藍(lán)(indigo)，6-(3-氧代吲哚啉-2-亞基)吲哚[2，1-b]喹唑-12-酮{6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2，1-b]quinazolin-12-one}，以及蒲公英的化合物蒲公英萜酮(taraxerone)，連接度值均是48，說明這3個(gè)化學(xué)成分很可能是消炎退熱合劑治療疾病的主要化學(xué)成分。其余化合物如鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、山柰酚、毛蕊異黃酮等連接度值是8，靛藍(lán)、十八碳二烯酸(ODD)、β-谷甾醇等連接度值是4。通過對(duì)靶點(diǎn)連接點(diǎn)度值分析得出，排名前5位的靶點(diǎn)分別是腎上腺素能受體β2抗體(ADRB2)(度值=57)、前列腺素過氧化物合酶1(PTGS1)(度值=39)、腫瘤壞死因子(TNF)(度值=25)、凝血酶原(F2)(度值=23)、腎素(REN)(度值=22)。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與COVID-19密切相關(guān)的靶點(diǎn)ACE2的連接度值為14。這結(jié)果說明消炎退熱合劑中化學(xué)成分可能不僅通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫實(shí)現(xiàn)治療疾病，還可能直接作用于病毒受體，實(shí)現(xiàn)防治COVID-19的作用。此結(jié)果初步闡明“中藥-歸經(jīng)-成分-靶點(diǎn)”的互作關(guān)系，揭示了消炎退熱合劑治療疾病的多靶點(diǎn)、多途徑屬性，其中大青葉節(jié)點(diǎn)度數(shù)較大，說明其君藥的用藥合理性。核心關(guān)鍵化合物為靛藍(lán)、γ-谷甾醇、β-谷甾醇、十八碳二烯酸等，主要?dú)w經(jīng)為胃、心經(jīng)，表明消炎退熱合劑可能通過多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮作用。

2.4 靶點(diǎn)通路分析

為了闡明消炎退熱合劑抗病毒感染肺炎作用的分子機(jī)制，將“成分-疾病”對(duì)應(yīng)的27個(gè)靶點(diǎn)通過Cluster profiler進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋，共富集到GO條目910，其中生物學(xué)過程(BP)867條(見圖3A)，分子功能(CC)6條(見圖3B)，細(xì)胞組成(MF)條目37條(見圖3C)，分別占95%、0.6%、4%。富集到KEGG信號(hào)通路10條(見圖4)，這些靶點(diǎn)主要分布于質(zhì)膜外側(cè)(GO：0009897，external side of plasma membrane)、鈣離子通道電壓門控(GO：0005891，voltage-gated calcium channel complex)和鈣離子通道復(fù)合體(GO：0034704，calcium channel complex)。其分子功能主要與受體配體活性(GO：0048018，receptor ligand activity)、G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合(GO：0001664，G protein-coupled receptor binding)、細(xì)胞因子活性(GO：0005125，cytokine activity)有關(guān)。其生物過程(BP)主要涉及脂多糖反應(yīng)(GO：0032496，response to lipopolysaccharide)、細(xì)菌來源分子效應(yīng)(GO：0002237，response to molecule of bacterial origin)和血壓調(diào)控(GO：0008217，regulation of blood pressure)。這些靶點(diǎn)主要調(diào)控的代謝通路為cAMP信號(hào)通路(hsa04024，cAMP signaling pathway)、病毒蛋白與細(xì)胞因子受體間相互作用(hsa04061，Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(hsa04668，TNF signaling pathway)、細(xì)胞因子相互作用受體通路(hsa04060，Cytokine-cytokine receptor interaction)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(hsa04614，Renin-angiotensin system)等。以上結(jié)果表明消炎退熱合劑中核心化合物可能通過干預(yù)ADRB2、PTGS1、TNF、F2、REN、ACE、ACE2等靶點(diǎn)來產(chǎn)生治療疾病的作用，并作用于cAMP通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子相互作用、TNF信號(hào)通路等減輕病毒誘發(fā)的炎癥風(fēng)暴損傷，并且有可能調(diào)控腎素-血管緊張素系統(tǒng)直接作用于病毒與宿主的結(jié)合。

注：A.GO(BP)結(jié)果分析圖B:GO(CC)結(jié)果分析圖;C.GO(MF)結(jié)果分析圖。圖3 消炎退熱合劑作用靶點(diǎn)的GO富集分析圖

圖4 消炎退熱合劑KEGG富集分析圖

2.5 消炎退熱合劑中活性化合物與ACE2的分子對(duì)接結(jié)果分析

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步將篩選出消炎退熱合劑的18個(gè)核心化學(xué)成分與病毒的結(jié)合受體ACE2進(jìn)行對(duì)接，通過DS篩選出消炎退熱合劑中潛在的核心治療疾病的化合物。采用LibDock分子對(duì)接方法，其打分函數(shù)LibDock Score是基于配體與受體對(duì)接時(shí)的親和力、相對(duì)能量和對(duì)接模式等進(jìn)行綜合打分，打分值>100說明配體與受體具有很好的結(jié)合。消炎退熱合劑中18個(gè)核心化學(xué)成分與ACE2的對(duì)接打分結(jié)果見表1。

表1 消炎退熱合劑中核心化合物與ACE2的分子對(duì)接結(jié)果

從結(jié)果中可以看出，來自大青葉的活性化合物靛藍(lán)(107.163)、γ-谷甾醇(106.398)、β-谷甾醇(119.955)，來自紫花地丁的活性化合物ODD(110.076)、亞油酸甲酯(107.172)，及來自甘草的高麗槐素(104.029)的對(duì)接分值接近或高于與臨床推薦治療COIVD-19的藥物氯喹(105.656)。因此，通過分子對(duì)接技術(shù)，本文最終篩選出消炎退熱合劑中6個(gè)核心化合物可能是治療COCID-19的核心活性成分(見表1)。β-谷甾醇、ODD、靛藍(lán)及高麗槐素與ACE2蛋白相互作用的3D及2D示意圖見圖5。

注：A.β-谷甾醇與ACE2蛋白結(jié)合3D圖；B.β-谷甾醇與ACE2蛋白相互作用2D圖；C.ODD與ACE2蛋白結(jié)合3D圖；D.ODD與ACE2蛋白相互作用2D圖；E.靛藍(lán)與ACE2蛋白結(jié)合3D圖；F.靛藍(lán)與ACE2蛋白相互作用2D圖；G.高麗槐素與ACE2蛋白結(jié)合3D圖；H.高麗槐素與ACE2蛋白相互作用2D圖。圖5 消炎退熱合劑中核心成分與ACE2蛋白相互作用圖

3 討論

中醫(yī)在防治瘟疫方面療效獨(dú)特，以“辨證施治、扶正祛邪”為治療原則。中醫(yī)藥在出血熱、甲流等流行性傳染病防治中，均發(fā)揮了重要的作用，尤其是在2003年的SARS中，中醫(yī)藥治療的安全性和有效性得到了廣泛認(rèn)可[16-17]。國際病毒分類委員會(huì)(ICTV)已將新型冠狀病毒正式命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，表明SARS-CoV-2是SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的近親。目前，中醫(yī)藥對(duì)于COVID-19的治療起到了重要作用。2020年2月14日，湖北省政府召開發(fā)布會(huì)，邀請(qǐng)中醫(yī)藥專家介紹中醫(yī)藥參與COVID-19疫情防控的有關(guān)情況。專家指出臨床采用中西醫(yī)聯(lián)合救治COVID-19能明顯提高救治的質(zhì)量，減少死亡，減少重癥變成危重癥的發(fā)生率。

本研究提出的消炎退熱合劑是臨床用于抗流感病毒的中藥制劑。本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)地分析預(yù)測(cè)消炎退熱合劑對(duì)于COVID-19的潛在作用機(jī)制。首先通過數(shù)據(jù)庫查詢獲取消炎退熱合劑中各個(gè)中藥的活性成分及其作用靶點(diǎn)，然后構(gòu)建中藥活性成分-靶點(diǎn)進(jìn)行分析，找到消炎退熱合劑的117個(gè)活性成分及其對(duì)應(yīng)的498個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，同時(shí)與找到冠狀病毒“Severe Acute Respiratory Syndrome”和“Respiratory Failure”相關(guān)的144個(gè)靶點(diǎn)，與消炎退熱合劑活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行交集分析，初步篩選出消炎合劑核心活性成分包括γ-谷甾醇、β-谷甾醇、靛藍(lán)、ODD等18個(gè)，以及對(duì)應(yīng)的疾病靶點(diǎn)27個(gè)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析消炎退熱合劑中藥物主要?dú)w心、胃經(jīng)，活性成分作用的主要疾病靶點(diǎn)可為幾個(gè)大類，一是與炎癥免疫相關(guān)的靶點(diǎn)有PTGS1、病毒蛋白與細(xì)胞因子受體相互作用、TNF；二是與病毒宿主結(jié)合復(fù)制相關(guān)的靶點(diǎn)有ACE、ACE2；三是與肺炎損傷機(jī)體的并發(fā)癥相關(guān)靶點(diǎn)如F2，F(xiàn)2是靜脈血栓形成的重要靶點(diǎn)，肺炎重癥患者長(zhǎng)期臥床易患靜脈血栓，以上均是消炎退熱合劑核心成分γ-谷甾醇、β-谷甾醇以及靛藍(lán)的作用靶點(diǎn)。2019-nCoV感染導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)和炎癥風(fēng)暴，此過程中大量細(xì)胞因子被激活[18]。已有研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子風(fēng)暴在新冠肺炎的病理進(jìn)展中起著非常關(guān)鍵的作用。因此，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生也是治療COVID-19的關(guān)鍵目標(biāo)[19-20]。KEGG分析得到與ADRB2、PTGS1、TNF、F2、REN、ACE、ACE2靶點(diǎn)相關(guān)且排名前6的通路，分別為炎癥細(xì)胞因子相關(guān)通路如病毒蛋白與細(xì)胞因子相互作用通路、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用通路等，推測(cè)消炎退熱合劑可能通過調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路起到抑制活化的細(xì)胞因子、緩和過激的免疫反應(yīng)、消除炎癥的作用。文獻(xiàn)報(bào)道表明[21]，ADRB2、REN、ACE、ACE2靶點(diǎn)和病毒蛋白細(xì)胞因子相互作用通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等在影響RNA病毒的結(jié)合、復(fù)制以及在治療肺炎的過程中起關(guān)鍵作用，說明利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)消炎退熱合劑治療COVID-19的潛在化學(xué)成分具有一定可靠性。cAMP通路是環(huán)核苷酸系統(tǒng)的一種，具有參與機(jī)體的發(fā)熱機(jī)制和炎癥的作用[22]，消炎退熱合劑也可能通過調(diào)控cAMP信號(hào)實(shí)現(xiàn)散熱、退熱的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)感染SARS-CoV的細(xì)胞中分離出腎素(REN)和血管緊張素II(Ang II)，它們可以和SARS-CoV的刺突蛋白高效結(jié)合，且細(xì)胞ACE2的表達(dá)量與SARS-CoV的S 蛋白的易感性正相關(guān)[23]。腎素-血管緊張素II是2019-nCoV結(jié)合ACE2受體激活的經(jīng)典途徑[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)消炎退熱合劑的活性成分不僅對(duì)ACE2的靶點(diǎn)有作用，且可以調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號(hào)通路，說明該復(fù)方可能含有直接抑制病毒與宿主結(jié)合的活性成分，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果預(yù)測(cè)消炎退熱合劑中潛在的治療病毒感染肺炎的多成分、多靶點(diǎn)的分子機(jī)制。

2013年Nature報(bào)道[26]，冠狀病毒的刺突蛋白三聚體先與ACE2的細(xì)胞外催化結(jié)構(gòu)域的“疏水口袋”結(jié)合，繼而細(xì)胞發(fā)揮內(nèi)吞作用，病毒包膜與細(xì)胞膜融合，最終進(jìn)入宿主細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)[27]，2019-nCoV中病毒感染的途徑也是通過其表達(dá)的S蛋白與ACE2的結(jié)合，導(dǎo)致病毒侵入機(jī)體而致病。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出消炎退熱合劑中靛藍(lán)、β-谷甾醇、γ-谷甾醇、ODD等18個(gè)核心化學(xué)成分，進(jìn)一步通過分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)與ACE2具有較強(qiáng)結(jié)合力的6個(gè)化學(xué)成分，為靛藍(lán)、β-谷甾醇、γ-谷甾醇、ODD、亞油酸甲酯及高麗槐素，與目前臨床上推薦用藥氯喹的結(jié)合力相當(dāng)，說明消炎退熱合劑可能對(duì)COVID-19具有潛在的治療作用。靛藍(lán)、β-谷甾醇、γ-谷甾醇、ODD、亞油酸甲酯及高麗槐素是否可以通過作用于ACE2受體調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路抗病毒有待進(jìn)一步工作的驗(yàn)證。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)消炎退熱合劑的化學(xué)成分、作用靶標(biāo)進(jìn)行了系統(tǒng)性的分析，從分子水平闡述了該復(fù)方可能通過多成分、多靶點(diǎn)對(duì)機(jī)體的整體調(diào)控，篩選出6個(gè)潛在的抗病毒活性化學(xué)成分，為該復(fù)方干預(yù)COVID-19提供了理論支持。