鄭思彤 錢倩宇 徐甜甜 吳相堯 竇曉兵 柴惠

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是排除過量飲酒或者其他導(dǎo)致肝脂肪變原因、和胰島素抵抗及遺傳密切相關(guān)的一種代謝應(yīng)激性損傷，其重要病理改變是肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)蓄積［1］。NAFLD 普通成人發(fā)病率為6.3%~45%，其中10%~30%是非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steato hepatitis，NASH），而包括中國在內(nèi)的大多數(shù)亞洲國家NAFLD 患病率>25%［2］。因脂肪性肝病與糖尿病、肥胖的發(fā)生密切相關(guān)，有預(yù)測［3］，至2030 年或有超過總?cè)丝?/3 的人患有脂肪性肝病，其中相當(dāng)一部分患者進(jìn)展成脂肪性肝炎。目前防治NAFLD 的藥物大多為化學(xué)合成，價格昂貴且副作用較多［4］。從化學(xué)合成物種篩選新藥越來越困難，迫使人們轉(zhuǎn)向天然藥物。我國是天然藥物資源大國［5］，傳統(tǒng)中藥藥效明確、毒副作用小，是篩選有效的治療脂肪肝新藥的重要研究方向［6-8］。本研究對梔子苷、三七皂苷R1、益母草苷、升麻素、石斛堿、白術(shù)內(nèi)脂I、黃芪甲苷、厚樸酚、鴉膽子素、竹節(jié)香附素A，10 種中藥單體進(jìn)行評價，為具有改善脂毒性功能的傳統(tǒng)中藥的開發(fā)及利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和設(shè)備

1.1 細(xì)胞和試劑 人肝癌細(xì)胞（HepG2）購于美國培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。甘油三酯（triglyceride，TG）檢測試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司（批號：E1003）；油 酸（oleic acid，OA）、 棕 櫚 酸（palmitic acid，PA）、DMEM、培養(yǎng)基噻唑藍(lán)［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT］、Hoechst33342 熒光染液均購于Sigma 公司（批號：75090、P5585、D5796、11465007001、H21842）；胎牛血清購于Biological industrie 公司（批號：04-00-1ACS）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒購于Thermo 公司（批號：TR20015）；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司（批號：P0010）；Bodipy493/503 染液購于Invitrogen 公司（批號：D2191）；梔子-梔子苷（Gardenoside，40μM）、三 七- 三 七 皂 苷R1（Notoginsenoside R1，50μM）、益母草-益母草苷（Ajugol，80μM）、防風(fēng)-升麻素（Cimifugin，40μM）、石斛-石斛堿（Dendrobine，40μM）、 白 術(shù)- 白 術(shù) 內(nèi) 脂I（Atractylenolide I，100μM）、黃芪-黃芪甲苷（Astragaloside，100μM）、厚 樸- 厚 樸 酚（Magnolol，20μM）、 鴉 膽 子- 鴉膽子素（Bruceine，50μM）、香附- 竹節(jié)香附素A（Anemodeanin A，20μM）均購于成都瑞芬思生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)時間2019 年3 月7 月。

1.2 主要儀器和設(shè)備 酶標(biāo)儀為美國MD 公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡購自Leica 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞融合至密度為80%~90%時進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）細(xì)胞干預(yù)：①細(xì)胞造模：取對數(shù)生長期細(xì)胞，以105個/ml 的數(shù)量接種在24 孔板內(nèi)，每孔體積1ml，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，設(shè)未加藥物的細(xì)胞為對照組，其余組別細(xì)胞分別予0.1、0.25、0.5mmol/L 的OA 干預(yù)12h，測定肝細(xì)胞內(nèi)TG 含量確定脂質(zhì)蓄積情況；0.1、0.25、0.5mmol/L 的PA 干預(yù)12h，LDH 法檢測細(xì)胞凋亡情況，選取最佳造模濃度。②藥物干預(yù)：取對數(shù)生長期細(xì)胞，以105個/ml 的數(shù)量接種于24 孔板內(nèi)，每孔體積1ml，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，設(shè)置空白對照組（UT 組）、模型組及藥物干預(yù)組，分別為A：梔子苷、B：三七皂苷R1、C：益母草苷、D：升麻素、E：石斛堿、F：白術(shù)內(nèi)脂I、G：黃芪甲苷、H：厚樸酚、I：鴉膽子素、J：竹節(jié)香附素A，各組活性單體預(yù)處理細(xì)胞2h，而后加入OA 或PA 干預(yù)12h，檢測相關(guān)指標(biāo)。（3）脂質(zhì)沉積檢測：①TG 含量檢測：細(xì)胞分組及藥物處理方案同上，采用TG 檢測試劑盒，測定細(xì)胞內(nèi)TG 的含量，并依據(jù)蛋白質(zhì)含量對TG 含量進(jìn)行校正。通過測定細(xì)胞內(nèi)TG 含量檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。②Bodipy 染色：脂質(zhì)染色采用Bodipy法，2μmol/L Bodipy 于37℃染色30min，棄染色液，PBS 洗滌2 次，熒光顯微鏡下檢測。（4）細(xì)胞損傷檢測：①LDH 法檢測細(xì)胞凋亡率：各給藥組分別收集細(xì)胞培養(yǎng)基30μl 加入96 孔板中，再加入LDH 工作液30μl，37℃孵育30min，加入終止液30μl，酶標(biāo)儀于440nm 處檢測吸光度（optical density，OD）值，細(xì)胞的損傷程度以各給藥組與空白對照組OD 值的比值表示。②MTT 檢測細(xì)胞存活率：細(xì)胞接種于96 孔板中，分組及藥物處理方案同上，棄去培養(yǎng)基，向96 孔板中加入MTT 溶液，孵育4h 后棄去上清液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）并振蕩充分溶解，酶標(biāo)儀于570nm 處檢測OD 值，計算細(xì)胞存活率。③Hoechst 染色：2μmol/L Hoechst33342 試劑于37℃染色30min，棄染色液，PBS 洗滌2 次，熒光顯微鏡下檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以（±s）表示，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性時組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂毒性模型建立 分別采用不同濃度的OA 和PA 干預(yù)后，與對照組比較，OA 呈劑量依賴關(guān)系顯著增加肝細(xì)胞內(nèi)TG 含量（P<0.05），見圖1A。且通過LDH 釋放量檢測，發(fā)現(xiàn)PA 在HepG2 細(xì)胞中也呈劑量依賴性方式表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡作用（P<0.05），見圖1B。隨著OA 和PA 的濃度增加，細(xì)胞內(nèi)脂毒性明顯上升，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用0.5mmol/L OA 和0.5mmol/L PA 作為干預(yù)因素。

2.2 10 種中藥單體的降脂活性 用不同單體預(yù)處理細(xì)胞后，再予0.5mmol/LOA 干預(yù)，結(jié)果顯示，與UT 組比較，OA 組TG 含量增加明顯（P<0.01）；與OA 組比較，三七皂苷、石斛堿、竹節(jié)香附素A 組TG 含量下降（P<0.05），梔子苷、升麻素及黃芪甲苷組TG 含量明顯減少（P<0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2A。用Bodipy 染色進(jìn)行觀察顯示，與UT 組比較，OA 組綠色熒光強(qiáng)度增加，脂質(zhì)堆積明顯，梔子苷、升麻素及黃芪甲苷組經(jīng)預(yù)處理后，與OA 組相比，綠色熒光強(qiáng)度顯著減弱，其余組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度無明顯影響。結(jié)果表明，梔子苷、升麻素及黃芪甲苷組可以減輕由OA誘導(dǎo)的脂質(zhì)堆積。見圖2B。

圖1 細(xì)胞脂毒性模型構(gòu)建

圖2 各組細(xì)胞脂質(zhì)沉積比較

2.3 10 種中藥單體的抗凋亡作用 經(jīng)各中藥單體預(yù)處理細(xì)胞2h，再以0.5mmol/LOA 干預(yù)12h，檢測培養(yǎng)基中LDH 水平，見圖3A。結(jié)果表明PA 導(dǎo)致LDH 釋放率明顯增加，細(xì)胞存活率下降（P<0.01），而梔子苷、升麻素及黃芪甲苷組LDH 釋放量明顯下降，顯示其可以減輕PA 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷（P<0.01）。見圖3B，MTT檢測結(jié)論與LDH 檢測結(jié)論一致，PA 導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降（P<0.01），而梔子苷、升麻素及黃芪甲苷組均能夠提高細(xì)胞存活率（P<0.01）。其余給藥組在抗細(xì)胞凋亡方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。用Hoechst33342 染色試劑盒進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)評估。見圖3C。對照組細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞間連接緊密，染色后觀察可見細(xì)胞核大小均一、圓滑，呈彌散均勻的藍(lán)色。PA 組用0.5mmol/LPA單獨(dú)處理12h 后，出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞，其特征是細(xì)胞形態(tài)變小，邊界收縮，細(xì)胞核出現(xiàn)濃染致密塊狀熒光。梔子苷、升麻素及黃芪甲苷組經(jīng)預(yù)處理后，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少。

圖3 各組細(xì)胞損傷和細(xì)胞存活率比較

3 討論

NAFLD 是全球最常見的慢性肝病，包括單純性脂肪肝、NASH、脂肪性肝纖維化和肝硬化。單純性脂肪肝時進(jìn)展緩慢，若發(fā)展為NASH，則肝內(nèi)巨噬細(xì)胞、星狀細(xì)胞活化，導(dǎo)致肝內(nèi)炎癥、纖維化的發(fā)生發(fā)展，最終可進(jìn)展為肝硬化、原發(fā)性肝癌等終末期肝病［9］。至今，NASH 的發(fā)病機(jī)制仍未清晰。血中游離脂肪酸（freefattyacids，F(xiàn)FAs）濃度升高、肝細(xì)胞脂性病變及細(xì)胞凋亡增加是NASH 的重要特征。當(dāng)循環(huán)中FFAs 水平升高至超過肝臟的氧化和代謝能力時，會引發(fā)脂質(zhì)在肝臟異位沉積、炎性因子釋放和凋亡信號啟動，同時肝細(xì)胞對炎性反應(yīng)和各種損傷因素的敏感性也增高，由此導(dǎo)致的肝細(xì)胞功能障礙或者死亡稱為脂毒性［10］；由此引起的肝細(xì)胞凋亡，則稱之為脂毒性凋亡。肝細(xì)胞脂毒性凋亡在NASH 的發(fā)生進(jìn)展中是十分重要的始動環(huán)節(jié)且參與整個發(fā)病過程。

在細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)中加入OA 和PA，在體外模擬體內(nèi)的游離脂肪酸濃度水平。利用TG 法及LDH 法檢測脂質(zhì)蓄積和細(xì)胞凋亡情況，確定0.5mmol/L 的OA 及0.5mmol/L 的PA 造模濃度，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。體外脂毒性模型建立后，進(jìn)行藥物活性的篩選，在查閱文獻(xiàn)后確定各藥物單體給藥濃度。經(jīng)過綜合考察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的變化，細(xì)胞凋亡情況后，篩選出三種能夠?qū)?xì)胞內(nèi)脂毒性產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的藥食同源中藥單體，分別為梔子苷（40μM），升麻素（40μM），黃芪甲苷（100μM），均可以降低由OA 誘導(dǎo)的脂質(zhì)蓄積，對PA 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。但其具體機(jī)制尚不清楚，有待課題組進(jìn)一步探究。

梔子、防風(fēng)、黃芪均具有活血通絡(luò)、祛肝經(jīng)之瘀等功效，在較多復(fù)方制劑中均起活血化瘀、保肝護(hù)肝的作用［11-13］。本研究中，梔子苷、升麻素、黃芪甲苷對游離脂肪酸誘導(dǎo)的脂毒性改善作用明顯，在細(xì)胞水平驗(yàn)證其明確療效，使其在抗脂毒性功能藥物開發(fā)方面顯示出較大的應(yīng)用前景，為今后傳統(tǒng)中藥改善脂毒性功能的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。