陳夢(mèng)娜 李善高

幽門(mén)螺桿菌（Hp）是一種嚴(yán)重影響公眾健康的革蘭氏陰性微需氧致病菌，可引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃黏膜相關(guān)組織淋巴瘤等胃部疾?。?］。1994 年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將Hp 定義為胃癌I 類(lèi)致病物［2］。我國(guó)目前Hp 感染率達(dá)50%，含鉍劑四聯(lián)已作為經(jīng)驗(yàn)性根除治療Hp 方案，隨著多種抗生素的耐藥率增高，Hp 感染根除殺菌已成為臨床治療的巨大挑戰(zhàn)。本研究通過(guò)測(cè)定不同Hp 感染程度的慢性胃炎患者殺菌前后的胃黏膜組織中miR-22 和NLRP3 炎癥小體表達(dá)水平變化，初步探討miR-22 及NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路在Hp 感染致病中的作用，旨在為Hp 相關(guān)性疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018 年1 月至2019 年3 月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡中心Hp 感染陽(yáng)性及同期Hp陰性慢性胃炎患者105例，其中陽(yáng)性組患者85例，男49 例，女36 例，年齡20~60 歲。根據(jù)感染程度分為輕度感染組18 例、中度感染組22 例、重度感染組45 例。陰性組患者20 例，男11 例，女9 例，年齡20~60 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）陽(yáng)性組患者，C14-尿素呼氣試驗(yàn)及胃黏膜組織切片HE 染色結(jié)果均為陽(yáng)性；（2）近期血液有關(guān)指標(biāo)如血常規(guī)、肝腎功能及凝血類(lèi)等均無(wú)明顯異常；（3）未曾有Hp 根除治療；（4）意識(shí)清楚，無(wú)認(rèn)知障礙等。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近1 個(gè)月內(nèi)使用抗生素、PPI、非甾體類(lèi)藥物、大劑量激素、免疫抑制劑等人群；（2）排除有嚴(yán)重藥物過(guò)敏史、孕婦、哺乳期婦女、藥癮者、酗酒者等；（3）排除嚴(yán)重消化性潰瘍、胃大部切除史、胃腸道惡性腫瘤等消化道疾患者，嚴(yán)重心、腦、肝、腎功能不全，嚴(yán)重風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，血液系統(tǒng)疾病，神經(jīng)精神性疾病等。本項(xiàng)目經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法 （1）14C-尿素呼氣試驗(yàn)：患者保持清晨空腹，檢測(cè)前漱口，而后通過(guò)溫涼飲用水（20ml）服用1 粒尿素C14 膠囊（藥物由深圳中核海得威生物公司提供）。靜坐15~20min 左右，將呼氣卡取出，沿呼氣口向卡內(nèi)進(jìn)行1~3min 的呼氣，期間允許換氣，忌吸氣，直至卡上指示窗的顏色由橙紅色變成黃色為止。將呼氣卡檢測(cè)窗口上的封簽揭去，插入HUBT-20 型幽門(mén)螺桿菌測(cè)試儀中，待儀器自動(dòng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以每分鐘衰變數(shù)（DPM/mmol）表示。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：陰性：DPM<100；陽(yáng)性：DPM ≥100。（2）胃黏膜組織標(biāo)本采集：所有研究對(duì)象均行常規(guī)胃鏡檢查，臨床醫(yī)師在胃鏡下使用相同批次的活檢鉗鉗取胃竇部位的胃黏膜組織標(biāo)本至少2 塊，每塊標(biāo)本大小約0.2cm×0.2cm，其中1 塊胃黏膜組織標(biāo)本置于10%福爾馬林中固定，另1 塊胃黏膜組織標(biāo)本立即于-80℃冰箱內(nèi)冷藏備用。（3）HE 染色：取出在10%福爾馬林中固定后的胃黏膜組織，沖洗干凈后依次放入低濃度和高濃度的乙醇進(jìn)行脫水處理，加入二甲苯進(jìn)行透明處理，使其充分替換出殘留在其中的乙醇。后將標(biāo)本放入石蠟塊中包埋，用切片機(jī)切成厚度約為4μm的薄片，再次加入二甲苯中脫蠟處理，依次放入高濃度和低濃度的乙醇，最后經(jīng)蒸餾水處理1 次。在處理好的切片中加入蘇木精染色溶液染色15min，并在鹽酸和氨水中各分色幾秒，用蒸餾水沖洗干凈后加入伊紅酒精溶液染色處理3min，將染色后的切片分別使用100%乙醇和二甲苯進(jìn)行脫水透明處理，并在切片上加入中性樹(shù)膠，放上蓋玻片進(jìn)行封固，放置于烤箱內(nèi)將其烘干，使用電子顯微鏡觀察胃黏膜組織病理形態(tài)改變，并拍照保存，貼上標(biāo)簽以備待查。通過(guò)在高倍顯微鏡下對(duì)胃黏膜的黏液層及上皮組織進(jìn)行觀察，對(duì)Hp感染程度進(jìn)行分組，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)［3］：切片上未見(jiàn)Hp 菌體表示無(wú)Hp 感染；見(jiàn)菌株分布<1/3 標(biāo)本全長(zhǎng)表示輕度Hp 感染（+）；>1/3 標(biāo)本全長(zhǎng)，不>2/3 區(qū)域表示中度Hp 感染（++）；Hp 菌株成堆存在，基本分布于標(biāo)本全長(zhǎng)表示重度Hp 感染（+++）。（4）RT-PCR 檢測(cè)miR-22，NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）mRNA 表達(dá)水平：將置于-80℃冰箱冷藏的胃黏膜組織取出，Trizol 法提取總RNA，取總RNA 1μg，以細(xì)胞總RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，制成20μl 逆轉(zhuǎn)錄體系；以1.0μl DNA 作為底物進(jìn)行Real-time PCR：在96X PCR 板各空中加入1.0μl cDNA、5xSYBR mix以及目的條帶引物，總反應(yīng)體系為20ul，置于熒光定量PCR 儀中。95℃5min 預(yù)變性后，95℃ 15s →63℃ 25s（收集熒光），40cycles，之后進(jìn)行溶解曲線實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)是否含有非特異性條帶擴(kuò)增。各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平以2（Ct 內(nèi)參基因－Ct 目的基因）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。RT-PCR 引物序列見(jiàn)表1。（5）Western blot 檢測(cè)胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)水平：將胃黏膜組織置于1~2ml 勻漿器中，經(jīng)PBS 洗滌后，用剪刀將其剪碎，向其中添加總蛋白提取試劑（含蛋白酶抑制劑混合液）靜置裂解，裂解30min 后，將裂解液移至1.5ml EP 管中，然后在4℃，12000rpm 離心15min，取上清分裝于1.5ml EP 管中并置于-20℃保存。后經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、染色、去離子水震蕩去除浮色，放入含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。將一抗用TBST 稀釋至適當(dāng)濃度，在4℃下孵育過(guò)夜，同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與PVDF膜接觸，室溫下孵育1h，洗滌后加入底物孵育，取出硝酸纖維素膜，蒸餾水漂洗后晾干，通過(guò)在暗盒中進(jìn)行約10min 的曝光來(lái)完成顯影和定影過(guò)程。并使用Image J 軟件分析每個(gè)條帶的光密度，并重復(fù)進(jìn)行3 次，靶蛋白的相對(duì)表達(dá)=［靶蛋白（光密度值）/內(nèi)部參數(shù)（光密度值）］×10n，最終結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（MeanSD）。所有陽(yáng)性組患者采用相同藥物方案進(jìn)行2周抗菌治療，1 個(gè)月后再次行14C-尿素呼氣試驗(yàn)、胃黏膜組織病理檢測(cè)以及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定（具體方法同上）。具體服藥方案：（泮托拉唑40mg+果膠鉍100mg）（2次/d，餐前30min 口服）+（阿莫西林1000mg+克拉霉素500mg）（2 次/d，餐后口服）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩用LSD-t 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 所有Hp 感染陽(yáng)性組患者密切隨訪，嚴(yán)格服用四聯(lián)藥物14d，且配合臨床醫(yī)師在療程結(jié)束1 個(gè)月后再次返院接受14C-尿素呼氣試驗(yàn)及胃鏡檢查，服藥期間無(wú)明顯身體不適，且飲食生活規(guī)律。根除治療結(jié)束后1 個(gè)月，因各種原因中斷治療10 例（其中輕度5 例，中度3 例，重度2 例）。Hp 根除成功率90.67%。

2.2 RT-PCR 檢 測(cè) 胃 黏 膜 組 織miR-22，NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 表 達(dá) 水 平 Hp 感 染 陽(yáng) 性 各組胃黏膜組織中miR-22 表達(dá)水平顯著低于陰性組（P<0.05），NLRP3 炎癥小體各組成成分mRNA 表達(dá)水平均高于陰性組；隨著Hp 感染程度的加重，miR-22表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，NLRP3 炎癥小體各組mRNA 則呈現(xiàn)與miR-22 相反趨勢(shì)，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在根除治療后，發(fā)現(xiàn)Hp 感染根除治療成功組miR-22 表達(dá)水平比對(duì)應(yīng)各組殺菌前水平升高（P<0.05），但仍低于陰性組水平；NLRP3 炎癥小體各組分mRNA 表達(dá)水平較對(duì)應(yīng)各組殺菌前水平降低。Hp 感染根除治療失敗組胃黏膜組織中的miR-22 及NLRP3 炎癥小體各組成成分mRNA 表達(dá)水平在根除治療前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組胃黏膜組織中miR-22，NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 Western blot 檢測(cè)胃黏膜組織中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá)水平 Hp 感染陽(yáng)性各組胃黏膜組織中NLRP3 炎癥小體各組分蛋白表達(dá)水平均高于陰性組（P<0.05）；隨著Hp 感染程度加重，其表達(dá)水平逐漸上升，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。根除治療后，Hp 根除治療成功組胃黏膜組織中NLRP3炎癥小體各組成成分蛋白表達(dá)水平較對(duì)應(yīng)各組殺菌前明顯下降，但仍高于陰性組水平，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Hp 根除治療失敗組胃黏膜組織中的NLRP3 炎癥小體各組成成分蛋白表達(dá)水平在根除治療前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組胃黏膜組織中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

Hp 最早于1893 年由意大利病理學(xué)家Bizzozero 首次在動(dòng)物胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)［4］，作為唯一可存活于胃內(nèi)的細(xì)菌，具有高致病性，其借助特有的毒力因子，長(zhǎng)期定植于宿主體內(nèi)，引起一系列Hp 相關(guān)性疾?。?］。有研究表明，Hp 感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病原因，且經(jīng)歷從慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎、不典型增生至胃癌的病理演變過(guò)程，在此過(guò)程中不同階段陽(yáng)性率有所差異［6］。我國(guó)Hp 感染率約為50%~90%，高于發(fā)達(dá)國(guó)家平均水平（50%~70%），各年齡段人群Hp 感染率存差異，而男女性別差異不明顯；不同種族、信仰以及受教育程度不同，Hp 感染同樣存在差異，作者認(rèn)為這可能與民族風(fēng)俗、生活習(xí)慣以及易感人群等原因有關(guān)［7］。目前推薦含鉍劑四聯(lián)（PPI+鉍劑+2 種抗生素）作為主要治療根除Hp 方案［8］。近年來(lái)，隨著臨床抗菌藥物的廣泛使用及經(jīng)驗(yàn)性治療方案的制定，致使我國(guó)Hp 對(duì)較多抗菌藥物耐藥，明顯降低臨床根除治療率［9］。因此，需尋求一種高效、且副作用小的根除Hp 的藥物。

miRNA 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)18~26 個(gè)核苷酸的高度保守的小分子RNA，其幾乎可以完全互補(bǔ)靶mRNA 的3'非編碼區(qū)（3'UTRs），并在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮降解作用；也可以與之不完全互補(bǔ)，在翻譯水平上抑制蛋白質(zhì)的合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［10］。成熟的miRNA 形成過(guò)程通常由RNA 聚合酶II 從相應(yīng)的基因組DNA 轉(zhuǎn)錄成初級(jí)miRNA，再經(jīng)核酶切割形成釋放至胞質(zhì)中。研究顯示miRNA 可參與細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥、腫瘤等多種生理病理過(guò)程［11-13］。

NLRP3 炎癥小體主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞，其異常表達(dá)可誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)［14］，是目前研究較多的炎癥小體，其受體蛋白是NOD 樣受體蛋白3，屬于NLRs 家族，NLRs家族由N 端的Caspase 募集和活化結(jié)構(gòu)域或熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD）、C 端富含亮氨酸的重復(fù)序列和中間的NACHT 結(jié)構(gòu)域（NOD 結(jié)構(gòu)域）3 部分組成。NLRP3 炎癥小體是由NLRP3、ASC 和Caspase-1 所組成蛋白復(fù)合物。其在激活后可通過(guò)Caspase-1 水解前體IL-1β（pro-IL-1β）、前體IL-18（pro-IL-18）和gasdermin D，使其形成并釋放具有活性的IL-1β、IL-18 和gasdermin D 的N 端片段，被多種病原相關(guān)的分子模式或損傷相關(guān)的分子模式活化，對(duì)固有免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程具有重要作用［15-17］。有實(shí)驗(yàn)以Hp 聯(lián)合N-甲基-N-亞硝酸脲（MNU）灌胃小鼠胃癌模型為研究對(duì)象［18］，結(jié)果顯示Hp 感染的組織中miR-22 表達(dá)抑制，而對(duì)NLRP3 的抑制減弱，誘發(fā)NLRP3 炎癥小體發(fā)生聚集及激活，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-1β。大量研究表明，NLRP3 是miR-22 的直接靶點(diǎn)，NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路在Hp 感染致炎過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本資料結(jié)果顯示，Hp 陽(yáng)性組患者胃黏膜組織中miR-22 表達(dá)水平低于陰性組，而NLRP3 炎癥小體各組成成分的基因及蛋白表達(dá)水平高于陰性組；在根除后的胃黏膜組織中，miR-22 表達(dá)水平升高，同時(shí)，NLRP3 炎癥小體各組分的基因與蛋白表達(dá)水平相較于根除前各組表達(dá)水平降低。作者認(rèn)為NLRP3 炎癥小體對(duì)胃黏膜具有致炎作用，而miR-22 則起到抑制炎癥的作用。在Hp 感染過(guò)程中，可能是通過(guò)抑制miR-22的表達(dá)，參與激活NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路，致使各炎癥因子大量釋放，從而導(dǎo)致胃黏膜的持續(xù)性病理?yè)p傷。但其是如何導(dǎo)致胃黏膜炎癥改變的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步的探索，明確此作用的關(guān)系可能為臨床中Hp 相關(guān)性疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。