徐淑琴 楊珺超 劉翠清 陳如程 王真 洪輝華

近年來(lái)隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，霧霾天頻發(fā)，給人類的生活和身心健康造成了嚴(yán)重的影響。近20年的流行病學(xué)資料表明，大氣污染與呼吸系統(tǒng)疾病的住院人數(shù)和死亡率存在著正相關(guān)的關(guān)系［1］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M春秋之季大氣污染環(huán)境，自擬杞菊湯對(duì)PM2.5 致小鼠急性肺損傷進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)治療，探討杞菊湯預(yù)防PM2.5 所致小鼠急性肺損傷的療效，以期為中醫(yī)藥預(yù)防此類疾病提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性ICR 小鼠44 只，體重（25±5）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供。實(shí)驗(yàn)時(shí)間2019 年9 月至10 月。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品制備 杞菊湯由枸杞子、杭白菊、馬齒莧等組成，藥品由浙江省中醫(yī)院中藥房提供，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心制備成含生藥0.713g/ml 的中藥濃縮藥液。將乙酰半胱氨酸制成0.0091g/ml 的乙酰半胱氨酸溶液，藥品由浙江省中醫(yī)院西藥房提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 小鼠TNF-α ELISA 試劑盒（70-EK282HS，聯(lián)科），小鼠IL-1β ELISA 試劑盒（70-EK201BHS，聯(lián)科），小鼠IL-6 ELISA 試劑盒（70-EK206HS，聯(lián)科），MDA 試劑盒（A003-1，南京建成），GSH-PX 試劑盒（A005，南京建成），205 暴露倉(cāng)（山東巨康空氣凈化科技有限公司定制CAPS-3），TGL-16 型臺(tái)式高速離心機(jī)，5810R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，DKB-454A 型電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），DGG-9240A 型電熱恒溫箱，752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），Bio-Tek ELX800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，-80℃低溫冰箱（美國(guó)Thermo），微量移液器（京君龍實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司）。

1.4 動(dòng)物模型的建立與處理 （1）動(dòng)物分組：44 只雄性ICR 小鼠隨機(jī)分成4 組，分別為正常組、模型組、乙酰半胱氨酸組和中藥組，每組各11 只。（2）染毒方法：在小鼠染毒造模前1 天對(duì)205 暴露倉(cāng)各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行調(diào)試，維持暴露倉(cāng)中PM2.5 濃度的濃縮倍數(shù)為6~10倍，溫度波動(dòng)范圍為20~25℃，于造模當(dāng)日將模型組、乙酰半胱氨酸組和中藥組小鼠放入205 暴露倉(cāng)內(nèi)，每日持續(xù)染毒10~12h，并通過(guò)暴露倉(cāng)中PM2.5 實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)其濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。（3）實(shí)驗(yàn)給藥和造模：各組小鼠在正常環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周，于實(shí)驗(yàn)第1 天起，正常組、模型組小鼠灌服0.9%生理鹽水0.01ml/（g·d），乙酰半胱氨酸組和中藥組小鼠分別灌服乙酰半胱氨酸溶液和杞菊湯0.01ml/（g·d），連續(xù)灌服7d。第8 天起，正常組小鼠放入潔凈倉(cāng)中，連續(xù)放入3d，另外三組小鼠放入205 暴露倉(cāng)中開(kāi)始染毒，連續(xù)染毒3d，10~12h/d。

1.5 觀察指標(biāo)及方法 （1）一般情況：觀察小鼠精神和活動(dòng)狀態(tài)，毛發(fā)光澤度，飲食二便和死亡情況，每日稱量并記錄小鼠體重；各組小鼠染毒造模期間，每日定時(shí)記錄暴露倉(cāng)中PM2.5 的濃度。（2）血清收集：采取摘眼球法收集小鼠外周血，用離心機(jī)在4℃、3000r/min 條件下離心10min，取上層血清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）指標(biāo)檢測(cè)：用ELISA 法檢測(cè)小鼠血清中TNF-α 的濃度，用生化法檢測(cè)小鼠血清中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）的含量，具體操作方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。（4）肺組織病理學(xué)觀察：摘取小鼠右側(cè)肺臟置于福爾馬林溶液中浸泡、固定，24h 后石蠟包埋，制作成5μm 厚的切片，脫蠟后，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，最后于光鏡下觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。多組間均數(shù)比較，若方差齊，使用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 法；若方差不齊，使用秩和檢驗(yàn)，兩兩比較用獨(dú)立樣本kruskal-wallis 檢驗(yàn)中的成對(duì)比較法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 灌胃期間各組小鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)靈敏，毛發(fā)光澤度佳，飲食二便正常，呼吸平穩(wěn)，體重自然緩慢增長(zhǎng)。模型組小鼠放入染毒倉(cāng)暴露3d 后，精神萎靡，活動(dòng)減少，毛發(fā)光澤度下降，飲食量相對(duì)減少，呼吸稍顯急促。乙酰半胱氨酸組小鼠放入染毒倉(cāng)暴露3d 后精神狀態(tài)一般，活動(dòng)較正常組小鼠稍有減少，毛發(fā)光澤度一般，進(jìn)食量與正常組小鼠相差不大，呼吸運(yùn)動(dòng)較模型組小鼠平穩(wěn)。中藥組小鼠放入染毒倉(cāng)暴露3d 后精神狀態(tài)尚可，喜靜，毛發(fā)略有光澤，飲食量無(wú)明顯變化，呼吸運(yùn)動(dòng)基本正常；實(shí)驗(yàn)期間中藥組因灌胃操作不當(dāng)死亡小鼠1 只；小鼠染毒造模期間205 暴露倉(cāng)中3d 平均PM2.5 濃度分別為209.8μg/m3、140.2μg/m3、225.5μg/m3。

2.2 肺組織病理學(xué)改變 正常組小鼠肺組織未見(jiàn)明顯病理學(xué)變化（見(jiàn)圖1）；模型組小鼠肺組織可見(jiàn)肺泡間隔斷裂，多個(gè)肺泡融合成肺大泡，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)有淡粉色液體滲出，部分小支氣管、肺毛細(xì)血管黏膜出現(xiàn)損傷，肺間質(zhì)、肺泡腔內(nèi)及支氣管周圍可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖2）；乙酰半胱氨酸組和中藥組小鼠可見(jiàn)肺組織炎性改變減輕，部分區(qū)域重現(xiàn)完整結(jié)構(gòu)、分布均勻的肺泡，肺泡腔內(nèi)滲出液相對(duì)減少，肺泡間隔有所變薄，部分損傷的支氣管、肺毛細(xì)血管管壁黏膜有所修復(fù)，肺間質(zhì)、肺泡、支氣管及肺毛細(xì)血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少（見(jiàn)圖3、圖4）。

圖1 正常組小鼠肺組織

圖2 模型組小鼠肺組織

圖3 乙酰半胱氨酸小鼠肺組織

圖4 中藥小鼠肺組織

2.3 各組小鼠血清中TNF-α、MDA、GSH-PX 表達(dá)比較 （1）各組小鼠血清中TNF-α 濃度比較：與正常組比較，模型組TNF-α 濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，乙酰半胱氨酸組TNF-α 濃度顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），中藥組TNF-α 濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；乙酰半胱氨酸組與中藥組TNF-α 濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）各組小鼠血清中MDA 含量比較：與正常組比較，模型組MDA 的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，乙酰半胱氨酸組MDA 的含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），中藥組MDA 含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；乙酰半胱氨酸組與中藥組MDA 的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）各組小鼠血清中GSH-PX含量比較：與正常組比較，模型組GSH-PX 的含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，乙酰半胱氨酸組GSH-PX 的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），中藥組GSH-PX 的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；乙酰半胱氨酸組與中藥組GSH-PX 的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1）。

表1 各組小鼠血清中TNF-α、MDA、GSH-PX的表達(dá)（±s）

表1 各組小鼠血清中TNF-α、MDA、GSH-PX的表達(dá)（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.01

組別 只 TNF-α（pg/ml） MDA（nmol/ml） GSH-PX（u）正常組 6 5.70±1.63 3.50±0.74 436.85±23.55模型組 6 9.98±2.16# 6.71±1.31# 338.06±28.01#乙酰半胱氨酸組 6 7.07±1.28** 4.86±1.08** 415.52±36.25**中藥組 5 8.15±1.38* 5.16±0.79** 389.53±25.20**

3 討論

大氣污染對(duì)人體的慢性毒害不容忽視，西醫(yī)學(xué)對(duì)此類疾病的治療注重防護(hù)為主，如霧霾天出門佩戴口罩，居家關(guān)閉門窗，在室內(nèi)擺放綠色植物等，中醫(yī)學(xué)常根據(jù)患者的癥狀、年齡、體質(zhì)和發(fā)病時(shí)節(jié)的不同，隨證治之，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)大多經(jīng)典方可緩解PM2.5 對(duì)呼吸系統(tǒng)造成的損害，如朱雪等［2］選用煤煙相關(guān)顆粒物建立肺損傷小鼠模型，玉屏風(fēng)散的預(yù)防性使用可提高小鼠細(xì)胞免疫以及體液免疫功能；師燕飛［3］選用煙熏染毒法建立肺損傷小鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血府逐瘀湯的干預(yù)可改善氣道炎癥反應(yīng)和氧自由基代謝紊亂，且可提高細(xì)胞免疫功能。許寧等［4］通過(guò)氣管滴注PM2.5 混懸液法建立肺損傷大鼠模型，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)連花清瘟可以拮抗大鼠肺部的炎性損傷。本實(shí)驗(yàn)采用霧化吸入法對(duì)小鼠進(jìn)行PM2.5 染毒，結(jié)果提示PM2.5的急性暴露可引起小鼠急性肺損傷，杞菊湯可通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激預(yù)防PM2.5 對(duì)小鼠肺組織造成的損害。

本實(shí)驗(yàn)采用205 暴露倉(cāng)更符合模擬人類在春秋之季遭受自然環(huán)境中PM2.5 毒害的過(guò)程，本次實(shí)驗(yàn)小鼠染毒時(shí)長(zhǎng)為10~12h，從早上8 點(diǎn)或10 點(diǎn)染毒至晚上8點(diǎn)，也符合人類日常作息規(guī)律；霧霾易耗傷人體津液，肺失濡養(yǎng)，可致口鼻咽干、干咳少痰，杞菊湯可潤(rùn)肺生津，利咽止咳；PM2.5 所攜帶的有毒物質(zhì)可在肺部日積月累，不易被人體所排泄，且外來(lái)之邪可影響人體氣血津液的運(yùn)行，使人出現(xiàn)咳痰，咯血，喘滿，胸悶等癥，杞菊湯可疏散外邪，清解內(nèi)毒?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明杞菊湯中所含的中藥均富含大量的維生素和類胡蘿卜素［5-8］，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素、維生素B、維生素C、維生素D、維生素E 可拮抗PM2.5對(duì)人體呼吸系統(tǒng)造成的損傷［9-10］。

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)炎性細(xì)胞因子和氧化/抗氧化系統(tǒng)的標(biāo)志性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，將來(lái)可對(duì)杞菊湯預(yù)防PM2.5 致急性肺損傷的具體作用機(jī)制進(jìn)一步研究。