龔立剛，艾成思，王夢萍

結(jié)腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在世界腫瘤相關(guān)死亡中位居第四位[1]。雖然CRC的手術(shù)治療和化療在過去幾年取得了較大的進展，但CRC患者的預(yù)后較差，5年生存率僅為50%～65%[2]。CRC是較為復(fù)雜的疾病，以腺瘤開始在慢性炎癥和持續(xù)感染等因素作用下經(jīng)過上皮細胞和癌前細胞突變的累積演變而來，但其發(fā)生發(fā)展的具體作用機制尚未明確[3]。同時CRC的重要特征為淋巴細胞浸潤和轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的治療困難是CRC患者死亡的重要原因[4]。因此，尋找CRC惡性進展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的調(diào)控因子，抑制其惡性生物學(xué)行為有助于改善患者預(yù)后。miRNAs是一類非編碼小RNA，在腫瘤中表達異常，參與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，廣泛調(diào)控腫瘤細胞的惡性行為[5-6]。而腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)是腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的主要原因[7]，而miRNAs在調(diào)控CSCs中的重要作用已經(jīng)在多種腫瘤中被證實[8]。miR-486-5p是目前研究較為成熟的miRNAs之一，在多種腫瘤中表達異常，其在CRC中低表達，并靶向多形性腺瘤基因1樣鋅指2(pleomorphic adenoma gene 1 like zinc finger 2, PLAGL2)參與致癌作用[9-10]。但miR-486-5p是否調(diào)控CRC CSCs未見有文獻報道，故該文旨在研究miR-486-5p與CRC CSCs的調(diào)控作用及初步作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；CRC細胞系和正常結(jié)腸細胞系NCM460購自美國ATCC細胞庫；細胞培養(yǎng)基及FBS購自美國Gibco公司；miR-486-5p mimic、突變型和野生型對叉頭盒O1(forkhead box class O1，F(xiàn)OXO1)的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)熒光素酶報告載體(FOXO1-wt、FOXO1-mut)及miR-486-5p過表達質(zhì)粒購自上海生工公司；MTS購自美國Promega公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Nanog、SOX2、OCT4、GAPDH抗體購自英國Abcam公司；裸鼠購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司。

1.2 qRT-PCRTRIzol裂解液提取細胞總RNA。設(shè)計合成miR-486-5p引物 F:5′-ACACTCCAGCT GGGTCCTGTACTGAGCTGCCC-3′ ，R：5′- CTCAACT GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCCCGAG-3′，以總RNA逆轉(zhuǎn)的cDNA作為模板按照說明書進行qRT-PCR。分析各樣品的循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)，采用2-ΔΔCt法分析各組實驗數(shù)據(jù)。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染DMEM高糖+10% FBS培養(yǎng)SW480、SW620和HT29細胞，McCoy’s 5A+10% FBS培養(yǎng)HCT116細胞，RPMI-1640+10% FBS培養(yǎng)NCM460細胞。將HCT116細胞無血清培養(yǎng)出的腫瘤球制成單個細胞后依次與小鼠抗人CD133抗體、小鼠抗人CD44抗體包被的磁珠孵育，分選出CD133/CD44雙陽性的細胞，無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。流式細胞儀檢測CSCs中CD133/CD44雙陽性細胞率。CSCs鋪至6孔板中，按說明書將對照組(NC)和miR-486-5p mimic轉(zhuǎn)染試劑與脂質(zhì)體2000混合后轉(zhuǎn)染至CSCs中，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 MTS實驗收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，以每組每孔2×103個細胞接種于96孔板中培養(yǎng)，共鋪0、24、48和72 h的細胞量，組內(nèi)設(shè)置6個復(fù)孔，在相應(yīng)的時間每孔加入30 μl MTS試劑，并在37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀490 nm處檢測各孔的吸光度(optical density, OD)值。

1.5 Transwell小室法檢測細胞轉(zhuǎn)移能力收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞無血清培養(yǎng)基洗3次，以每孔1×105個細胞、100 μl無血清培養(yǎng)基接種于Transwell小室中，500 μl的完全培養(yǎng)基加入下室，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 h終止培養(yǎng)，甲醛固定5 min，蘇木精染色。顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野膜上的細胞數(shù)目。

1.6 Boyden法檢測細胞侵襲能力收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞無血清培養(yǎng)基洗3次，以每孔1×105個細胞、100 μl無血清培養(yǎng)基接種于Boyden上，其他步驟同Transwell小室實驗。

1.7 裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建miR-486-5p過表達質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒vector，與脂質(zhì)體2000混合后轉(zhuǎn)染CSCs，96 h后更換含1.0 μg/ml 遺傳霉素 (geneticin, G418)的新鮮培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達的細胞，隔天更換1次，直至所有細胞均可觀察到熒光。將篩選的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株CSCsmiR-486-5p和CSCsvector以6×107個/ml分別注射到4周齡左右的裸鼠右側(cè)腋下。每4 d測量1次瘤子的體積，4周后處死裸鼠，該實驗的所有操作均符合動物倫理學(xué)。

1.8 miR-486-5p靶基因的驗證TargetScan 7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預(yù)測miR-486-5p的靶基因。雙熒光素酶報道基因?qū)嶒灧謩e將以下4組共轉(zhuǎn)染到CSCs中：FOXO1-wt與miR-486-5p mimics共轉(zhuǎn)染組(FOXO1-wt + miR-486-5p)；FOXO1-wt與NC共轉(zhuǎn)染組(FOXO1-wt+NC)；FOXO1-mut與miR-486-5p mimics共轉(zhuǎn)染組(FOXO1-mut+miR-486-5p)；FOXO1-mut與NC共轉(zhuǎn)染組(FOXO1-mut+NC)，收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，根據(jù)雙熒光素酶報道基因檢測說明書檢測各組熒光素酶活性。

1.9 Western blot檢測蛋白表達各組細胞加入RIPA冰上裂解10 min后，超聲儀裂解30 min后離心。將上清液移至新的EP管中，BCA液檢測蛋白濃度后煮沸變性，50 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)，8%脫脂牛奶室溫封閉1 h，Nanog、SOX2、OCT4、GAPDH(稀釋濃度為1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次后，室溫孵育兔二抗(稀釋濃度為1 ∶8 000)1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光條帶。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測miR-486-5p在CRC細胞系中的表達qRT-PCR檢測miR-486-5p在CRC細胞系SW480、HCT116、SW620和HT29中的表達分別為0.45±0.08、0.67±0.09、0.38±0.10、0.81±0.13，在正常結(jié)腸細胞系NCM460中的表達為1.01±0.04，miR-486-5p在CRC細胞系中的表達低于正常CRC細胞系中的表達(F=15.43，t=0.036)。見圖1。

圖1 miR-486-5p在CRC細胞系中的表達

2.2 CRC CSCs的分選與鑒定利用抗體包被的磁珠從HCT116細胞培養(yǎng)的腫瘤球中(圖2A)分選出CD133/CD44雙陽性的細胞(圖2B)，擴大培養(yǎng)后流式細胞儀檢測CD133/CD44雙陽性細胞為94.06%，Western blot檢測Nanog、OCT4和SOX2干性標(biāo)志蛋白在CD133/CD44雙陽性細胞中的表達高于在CD133/CD44非雙陽性細胞中的表達(圖2C)。

2.3 miR-486-5p在CRC CSCs中的表達qRT-PCR結(jié)果顯示miR-486-5p在CSCs(CD133/CD44雙陽性)中的表達為0.31±0.06 低于在HCT116(CD133/CD44非雙陽性)中的表達1.01±0.04。miR-486-5p mimic轉(zhuǎn)染CSCs，qRT-PCR檢測顯示miR-486-5p mimic組中miR-486-5p的表達(9.36±1.15)高于NC組(1.05±0.05)，均P<0.05(圖3)。

圖2 CRC CSCs的分選與鑒定

A：無血清培養(yǎng)的HCT116細胞腫瘤球 ×100；B：磁珠分選出的HCT116細胞腫瘤球 ×100；C：Nanog、OCT4和SOX2干性標(biāo)志蛋白在CD133/CD44雙陽性細胞中的表達

圖3 qRT-PCR檢測miR-486-5p在CRC CSCs中的表達水平

與CD133/CD44非雙陽性細胞比較：*P<0.05；與NC組比較，#P<0.05

2.4 MTS檢測miR-486-5p過表達對CSCs增殖的影響采用MTS法研究miR-486-5p對CSCs細胞增殖能力的影響，與NC組相比，miR-486-5p mimic組細胞增殖能力減慢(P<0.05,圖4)。

2.5 Transwell小室檢測miR-486-5p過表達對CSCs轉(zhuǎn)移能力的影響采用Transwell小室研究miR-486-5p對CSCs細胞轉(zhuǎn)移能力的影響， miR-486-5p mimic和NC組細胞穿膜數(shù)分別為(110.01±10.99)、(168.22±15.37)個。miR-486-5p mimic組細胞轉(zhuǎn)移能力低于NC組(P<0.05，圖5)。

2.6 Boyden檢測miR-486-5p過表達對CSCs侵襲能力的影響采用Boyden小室研究miR-486-5p對CSCs侵襲能力的影響miR-486-5p mimic和NC組細胞穿膜數(shù)分別為(82.35±14.67)、(138.68±11.93)個。miR-486-5p mimic組細胞侵襲能力低于NC組(P<0.05，圖6)。

2.7 miR-486-5p對CSCs體內(nèi)致瘤能力的影響將穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系CSCsmiR-486-5p和CSCsvector注射到裸鼠右側(cè)腋下，觀察皮下瘤體的生長速度，每隔3 d測量1次成瘤體積，繪制瘤體積曲線，4周左右時處死裸鼠，解剖出瘤體，觀察瘤體的大體觀。結(jié)果顯示：CSCsmiR-486-5p組裸鼠體積顯著低于CSCsvector組(圖7A、B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖7 miR-486-5p對CRC CSCs細胞體內(nèi)致瘤性的影響

A：裸鼠解剖瘤體大小；B：裸鼠成瘤體積；與CSCsvecto比較：*P<0.05

2.8 miR-486-5p對FOXO1的調(diào)控TargetScan 7.1軟件在線預(yù)測顯示FOXO1啟動子區(qū)有miR-486-5p的結(jié)合位點(圖8A)。近一步雙熒光素酶報道基因?qū)嶒烇@示：與FOXO1-wt+NC共轉(zhuǎn)染組相比，F(xiàn)OXO1-wt+miR-486-5p共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性降低(P<0.05)；而FOXO1-mut+NC和FOXO1-mut+miR-486-5p組之間的熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05，圖8B)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC轉(zhuǎn)染組比較，miR-486-5p mimic組CSCs中FOXO1 mRNA表達水平下降(P<0.05，圖8C)。

3 討論

CRC是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥導(dǎo)致患者的生存率不佳[1-2]，雖然CRC的發(fā)病機制引起廣大學(xué)者的關(guān)注，但是具體的發(fā)病機制尚未明確，因此從分子水平研究CRC的發(fā)生發(fā)展機制以尋找治療CRC的候選靶點仍迫切需要。miRNAs是非編碼RNA家族中的小RNA，長度為19 ～ 25 bp，密切參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究[6]發(fā)現(xiàn)CRC中存在miRNAs異常表達譜，miR-34a在奧沙利鉑耐藥CRC患者組織中低表達，外源性miR-34a的異位表達可使多藥耐藥的CRC HCT-8/OR細胞重新奧沙利鉑的治療增敏，而miR-34a的抑制增強了HCT-8細胞對奧沙利鉑的抗性，提示miRNAs具有作為藥物靶點的潛能，為研究腫瘤治療的熱點。

圖8 miR-486-5p對FOXO1的調(diào)控作用

A：TargetScan 7.1軟件預(yù)測FOXO1與miR-486-5p的結(jié)合位點；B：雙熒光素酶報道基因試驗檢測miR-486-5p靶向FOXO1；C：qRT-PCR檢測FOXO1 mRNA在miR-486-5p mimic組中的表達水平；與NC組比較：*P<0.05，#P<0.05

CSCs是可以從腫瘤組織和細胞中培養(yǎng)分離出的具有干細胞相似功能，即多能性和分化潛能的一類細胞[7]，CSCs的分離和培養(yǎng)方法的日漸成熟，從CSCs的角度研究CRC新的治療方法具有重大意義。CSCs的惡性生物學(xué)行為即增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和體內(nèi)致瘤性等統(tǒng)稱為CSCs的干性[11]，miRNAs在調(diào)控CSCs干性方面的重要作用也逐步被證實。文獻報道m(xù)iR-486-5p在CRC中低表達，其中Liu et al[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-486-5p下降與TNM晚期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，上調(diào)miR-486-5p抑制CRC細胞增殖和遷移。Zhang et al[10]報道m(xù)iR-486-5p通過靶向PIK3R1減少AKT信號通路的激活來抑制CRC的進展。miR-486-5p在CRC中低表達是否調(diào)控CRC CSCs的干性未見有報道，Shaham et al[12]在兒童急性髓性白血病研究中發(fā)現(xiàn)miR-486-5p的異位表達可以增強原發(fā)性胎肝造血祖細胞的自我更新能力，提示miR-486-5p可能參與調(diào)控CSCs的干性。本研究顯示miR-486-5p在CRC細胞系中的表達水平均低于正常細胞系中的表達水平，與已有的報道研究一致[9-10]，表明miR-486-5p在CRC中可能為抑癌因子。為研究miR-486-5p是否調(diào)控CRC CSCs的干性，首先培養(yǎng)CRC CSCs，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示miR-486-5p在CSCs中的表達低于CD133/CD44非雙陽性的細胞，而miR-486-5p mimic轉(zhuǎn)染CSCs，MTS增殖實驗、Transwell、Boyden和體內(nèi)裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示miR-486-5p過表達后CSCs增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和體內(nèi)致瘤能力均下降。

已經(jīng)觀察到miR-486-5p過表達抑制CRC CSCs的干性，但是其具體的作用機制需進一步研究。miRNAs 通過與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控靶基因的表達。已經(jīng)證實的miR-486-5p的miR-486-5p靶基因為PLAGL2、PIK3R1等基因[9-10]。TargetScan7.1預(yù)測軟件預(yù)測miR-486-5p存在上百個靶基因，其中轉(zhuǎn)錄因子FOXO1屬于叉頭O家族蛋白，在多種腫瘤中表達異常，在CRC中表達增加為癌基因[13]。而同時FOXO1與CSCs的調(diào)控具有密切關(guān)系，F(xiàn)OXO1在乳腺癌中促進CSCs腫瘤球形成[14]；FOXO1在人急性髓性白血病CD34+細胞中的表達促進其自我更新能力，是激活干細胞分子特征所必須的，靶向FOXO1可能是在白血病前期和白血病期消除干細胞的潛在治療策略[15]。因此課題組設(shè)想miR-486-5p可能通過靶向抑制FOXO1的表達調(diào)控CRC CSCs的干性，對此采用雙熒光素酶報道基因?qū)嶒烌炞CmiR-486-5p是否直接靶向調(diào)控FOXO1，結(jié)果證實FOXO1為miR-486-5p直接調(diào)控的靶基因。同時CRC CSCs轉(zhuǎn)染miR-486-5p mimic后，qRT-PCR結(jié)果顯示CSCs中FOXO1 mRNA表達水平減少，表明miR-486-5p可能通過靶向負調(diào)控FOXO1抑制CRC CSCs的干性，但其深入的作用機制需在后續(xù)研究中進行探討。

綜上所述，miR-486-5p低表達于CRC細胞系和CSCs中，在CSCs中過表達miR-486-5p顯著抑制CSCs的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和體內(nèi)致瘤能力，其初步機制可能是通過負調(diào)控FOXO1抑制CSCs的干性，miR-486-5p可能為消除CSCs治療CRC的潛在靶點。