王 磊，陳 鶴，張 敏，王中新

胃癌作為目前常見的惡性腫瘤之一[1]，具有較復(fù)雜的發(fā)病、侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制。其癌變過程是長期的細(xì)胞生物學(xué)行為由正常演變?yōu)楫惓５倪^程, 其發(fā)病與端粒酶激活、抑癌基因失活和癌基因激活等引發(fā)的多因素、多階段及多基因變異相關(guān)[2-3]。

目前有關(guān)MAST3基因的研究主要集中在炎癥性腸病中，研究[4-5]表明缺失MAST3的細(xì)胞能夠使Toll樣受體4依賴的NF-κB的活性下降，由此也進(jìn)一步證明了NF-κB途徑在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。但對于MAST3基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制等尚未完全明確。本研究旨在觀察MAST3在胃癌中的表達(dá)情況以及探索干擾及過表達(dá)MAST3對胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞增殖及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑胎牛血清來源于美國PAN公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；Opti-MEM購自美國Gibco公司；轉(zhuǎn)染使用的Lipofectamine 2 000 Reagent試劑購自美國Invitrogen公司；人外源性生長因子TGF-β購自美國PeproTech公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和SYBR Green PCR Master Mix均購自日本TOYOBO公司；RIPA裂解液和細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠抗β-actin抗體和兔抗MAST3抗體購自美國Bioworld公司；山羊抗兔和山羊抗小鼠的二抗購自北京中杉生物技術(shù)公司；細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、C-myc抗體、MMP-3和MMP-9購自美國Cell signaling technology公司；MAST3的過表達(dá)質(zhì)粒與小干擾RNA均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 樣本收集與細(xì)胞培養(yǎng)選取臨床中6例33～78(61±4.8)歲胃癌患者，在手術(shù)后分別選取胃癌和癌旁組織，生理鹽水清洗后，多聚甲醛固定和冰凍保存，同時患者已簽署知情同意書。

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞來自安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院贈送，使用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染使用對數(shù)生長期的細(xì)胞, 按照說明書使用Lip2000將MAST3-RNAi和pEx-3-MAST3分別轉(zhuǎn)染到SGC-7901細(xì)胞中，6 h后使用TGF-β進(jìn)行刺激。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 qRT-PCR檢測細(xì)胞中MAST3、CyclinD1、C-myc、MMP-3和MMP-9 mRNA的表達(dá)使用TRIzol法提取組織和細(xì)胞中總RNA，并使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)SYBR Green PCR Master Mix說明書步驟進(jìn)行qRT-PCR檢測。

1.5 Western blot印跡法檢測細(xì)胞中MAST3、CyclinD1、C-myc、MMP-3和MMP-9蛋白表達(dá)的改變收集組織和處理后的細(xì)胞，并使用蛋白裂解液裂解；離心后提取組織和細(xì)胞中的總蛋白，并加入SDS-蛋白上樣緩沖液煮沸變性。使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測蛋白相對表達(dá)量。按照組別依次加樣，依次電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗(稀釋濃度均為1 ∶500)孵育過夜，之后二抗(稀釋濃度均為1 ∶5 000)孵育1 h。使用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描成像并分析。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期收集處理后的細(xì)胞，冷PBS清洗2次后，使用70%乙醇固定變性過夜。離心、清洗后收集細(xì)胞，根據(jù)說明書加入500 μl 緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入RNaseA、PI，4 ℃避光孵育30 min后上機(jī)檢測分析。

2 結(jié)果

2.1 MAST3在胃癌組織中的表達(dá)為了探究MAST3在胃癌中的作用，本研究首先選取胃癌組織和癌旁組織，并通過Western blot和qRT-PCR檢測MAST3的表達(dá)情況。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，胃癌組織中MAST3 mRNA和蛋白表達(dá)均高于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(F=21.36，P<0.01；F=18.76，P<0.01)，見圖1A、1B。同時，本研究還檢測了TGF-β1對胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞中MAST3的表達(dá)的影響，TGF-β1能夠上調(diào)SGC-7901細(xì)胞中MAST3 mRNA和蛋白的表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(F=33.81，P<0.01；F=28.71，P<0.01)，見圖1A、1C。提示，MAST3與胃癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系。

2.2 沉默MAST3對SGC-7901細(xì)胞增殖及遷移的影響使用MAST3-RNAi沉默SGC-7901細(xì)胞中MAST3的表達(dá)，觀察對SGC-7901細(xì)胞增殖和遷移的影響。qRT-PCR和Western blot結(jié)果證實(shí)MAST3-RNAi能夠降低TGF-β1刺激SGC-7901細(xì)胞中MAST3 mRNA和蛋白的表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)，見圖2A、2B。同時本研究還檢測了細(xì)胞增殖相關(guān)基因C-myc和 CyclinD1的表達(dá)變化，qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明MAST3-RNAi能夠降低TGF-β1刺激SGC-7901細(xì)胞中C-myc和 Cy-clinD1 mRNA和蛋白的表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)，見圖2C、2D。細(xì)胞周期研究結(jié)果也表明，MAST3-RNAi組S期和G2/M期細(xì)胞比例(45±5.2)%明顯低于NC-RNAi組S期和G2/M期細(xì)胞比例(65±8.7)%，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，見圖2E。本研究檢測了細(xì)胞遷移相關(guān)基因MMP-3和MMP-9的表達(dá)變化，qRT-PCR和Western blot結(jié)果都表明MAST3-RNAi能夠下調(diào)TGF-β1刺激SGC-7901細(xì)胞中MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)，見圖2F、2G。提示抑制MAST3表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖及遷移能力。

圖1 MAST3在胃癌中的表達(dá)變化

A：qRT-PCR檢測MAST3 mRNA表達(dá)，胃癌組織(左側(cè))，TGF-β1刺激SGC-7901細(xì)胞(右側(cè))；B：Western blot檢測MAST3 蛋白在胃癌中的表達(dá)；C：Western blot檢測TGF-β1刺激SGC-7901細(xì)胞中MAST3蛋白的表達(dá)；1：癌旁組織；2：胃癌組織；3：對照組；4：TGF-β1刺激組；與癌旁組織比較：**P<0.01；與對照組比較：##P<0.01

2.3 過表達(dá)MAST3對SGC-7901細(xì)胞增殖及遷移的影響為了進(jìn)一步探究MAST3在胃癌中的作用，使用過表達(dá)質(zhì)粒pEx-3-MAST3過表達(dá)SGC-7901細(xì)胞中MAST3的表達(dá)。qRT-PCR和Western blot結(jié)果證實(shí)pEx-3-MAST3能夠增加TGF-β1刺激SGC-7901細(xì)胞中MAST3 mRNA和蛋白的表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)，見圖3A、3B。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明pEx-3-MAST3能夠升高TGF-β1刺激SGC-7901細(xì)胞中C-myc和CyclinD1 mRNA和蛋白的表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)，見圖3C、3D。細(xì)胞周期結(jié)果也表明，pEx-3-MAST3組S期和G2/M期細(xì)胞比例(77±4.8)%高于pEx-3組S期和G2/M期細(xì)胞比例(66±5.1)%，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，見圖3E。qRT-PCR和Western blot結(jié)果也都表明pEx-3-MAST3能夠上調(diào)TGF-β1刺激SGC-7901細(xì)胞中MMP-3和 MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)，見圖3F、3G。提示，增加MAST3表達(dá)能夠增加胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖及遷移能力。

圖2 MAST3-RNAi對SGC-7901細(xì)胞增殖及遷移的影響

A：qRT-PCR檢測MAST3 mRNA在SGC-7901中的表達(dá)；B：Western blot檢測MAST3蛋白在SGC-7901中的表達(dá)；C：qRT-PCR檢測SGC-7901細(xì)胞中C-myc和CyclinD1 mRNA的表達(dá)；D：Western blot檢測SGC-7901細(xì)胞中C-myc和CyclinD1蛋白的表達(dá)；E：流式細(xì)胞儀檢測SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞周期；F：qRT-PCR檢測SGC-7901細(xì)胞中MMP-3和MMP-9 mRNA的表達(dá)；G：Western blot檢測SGC-7901細(xì)胞中MMP-3和MMP-9蛋白的表達(dá)；1：正常組；2：TGF-β1刺激組；3：TGF-β1刺激+NC-RNAi組；4：TGF-β1刺激+MAST3-RNAi組；與正常組比較：##P<0.01；與TGF-β1刺激+NC-RNAi組比較：**P<0.01

圖3 pEx-3-MAST3對SGC-7901細(xì)胞增殖及遷移的影響

A：qRT-PCR檢測MAST3 mRNA在SGC-7901中的表達(dá)；B：Western blot檢測MAST3蛋白在SGC-7901中的表達(dá)；C：qRT-PCR檢測SGC-7901細(xì)胞中C-myc和 CyclinD1 mRNA的表達(dá)；D：Western blot檢測SGC-7901細(xì)胞中C-myc和CyclinD1蛋白的表達(dá)；E：流式細(xì)胞儀檢測SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞周期；F：qRT-PCR檢測SGC-7901細(xì)胞中MMP-3和MMP-9 mRNA的表達(dá)；G：Western blot檢測SGC-7901細(xì)胞中MMP-3和MMP-9蛋白的表達(dá)；1：正常組；2：TGF-β1刺激組；3：TGF-β1刺激+ pEx組；4：TGF-β1刺激+pEx-3-MAST3組；與正常組比較：##P<0.01；與TGF-β1刺激+pEx組比較：**P<0.01

3 討論

胃癌發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，尚未能完全明確，目前仍未有徹底治愈胃癌的治療手段。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與的復(fù)雜過程, 包括癌基因的異常激活和抑癌基因失活[6]。隨著細(xì)胞分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，腫瘤的基因靶向治療成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，為尋求新的治療方式應(yīng)用于臨床，以達(dá)到更好的治療效果。

MAST家族是相對未知的激酶分支，而MAST3是MAST家族成員之一，序列同一性分析以及功能測定已顯示MAST3參與許多細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)過程[7-8]。有研究[5]顯示MAST3在鼠和人的免疫細(xì)胞中表達(dá)，同時闡明MAST3在調(diào)節(jié)腸道炎癥中蛋白質(zhì)相互作用中的功能將有助于確定導(dǎo)致腸道炎癥的復(fù)雜分子機(jī)制[9-10]。本研究中, 通過qRT-PCR及Western blot檢測MAST3的表達(dá)，結(jié)果表明胃癌中MAST3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織，說明MAST3與胃癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系。

TGF-β1是一種轉(zhuǎn)化生長因子，它通常被用來誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移等，從而加重胃癌的發(fā)生發(fā)展[11]。本研究顯示TGF-β1能夠增加胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞中MAST3 mRNA和蛋白的表達(dá)。同時，本研究還顯示MAST3表達(dá)可以影響細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和癌基因C-myc表達(dá)。CyclinD1和C-myc已經(jīng)被證明參與細(xì)胞的增殖，能夠反映細(xì)胞增殖情況[12]。Western blot和qRT-PCR結(jié)果表明，使用MAST3-RNAi后，CyclinD1、C-myc的蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào)。相反，pEx-3-MAST3增加MAST3表達(dá)后，CyclinD1、C-myc的蛋白及mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。說明MAST3可能參與胃癌細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步確認(rèn)并觀察MAST3對細(xì)胞增殖的作用，本研究還分析細(xì)胞周期情況，結(jié)果顯示MAST3-RNAi能夠降低SGC-7901細(xì)胞中S期和G2/M期細(xì)胞比例，抑制了細(xì)胞的有絲分裂，從而阻滯了細(xì)胞增殖；同時，過表達(dá)MAST3后，能夠增加SGC-7901細(xì)胞中S期和G2/M期細(xì)胞比例。這進(jìn)一步說明了MAST3的表達(dá)可以調(diào)控SGC-7901細(xì)胞的增殖，從而參與胃癌的發(fā)生。

本研究還表明MAST3表達(dá)可以影響SGC-7901細(xì)胞的遷移。Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示，使用MAST3-RNAi后，MMP-9和MMP-3的蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào)。相反，pEx-3-MAST3增加MAST3表達(dá)后，MMP-9和MMP-3的蛋白及mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。提示MAST3可能會影響SGC-7901細(xì)胞的遷移。