王加侖，廉海光，林鳳顏，李 建

在動物模型中研究[1-2]表明，新生期一些麻醉劑的暴露可導致長期認知功能和記憶障礙。而在新生兒期-幼兒期臨床麻醉的研究的結(jié)果中存在爭議，有研究[3]認為麻醉劑對認知無影響，而大部分研究[4-6]表明麻醉劑可導致多種神經(jīng)認知障礙，尤其是在有麻醉史的患兒，其發(fā)育和行為呈現(xiàn)出一定的缺陷。這種結(jié)果的不同可能來源于麻醉劑型、麻醉深度、麻醉時間、麻醉史和個體的差異。另外，部分麻醉造成的認知功能損傷能在麻醉術后恢復[7]，因此，探索麻醉劑對神經(jīng)發(fā)育的長期效應更有助于新生兒期麻醉應用的管理。七氟醚為新生兒科常用的吸入性麻醉劑?，F(xiàn)采用6～7 d齡新生小鼠，給予三階段七氟醚暴露，在2月齡時通過行為學實驗及全細胞膜片鉗檢測小鼠學習記憶能力及突觸的可塑性，從而闡明新生期小鼠七氟醚暴露對發(fā)育期學習記憶能力及突觸可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 C57/BL6新生鼠(6～7 d齡)購自海南省藥物研究所[SCXK(瓊)2015-0007]，飼養(yǎng)于海南省藥品檢驗所的相對濕度45%～55%、每天光照12 h條件下的SPF動物房[SYXK(瓊)2016-0009]，動物實驗通過海南省藥品檢驗所實驗動物倫理委員會批準(No.HNYJS201811043)。

1.1.2主要試劑 抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)抗體(#sc-1012)購自美國Santa Cruz公司；抗半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)抗體(#ab58962)購自美國Abcam公司。

1.1.3主要儀器 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(型號：SA201)和條件與關聯(lián)條件恐懼分析系統(tǒng)(型號：SA897)購自江蘇賽昂斯生物科技有限公司；社會交互三箱實驗分析系統(tǒng)(型號：SX152)購自上海欣軟信息科技有限公司；單細胞膜片鉗記錄分析系統(tǒng)(型號：MutiClamp 700B)購自美國Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠七氟醚暴露與分組 30只新生鼠隨機分為對照組和七氟醚暴露組，每組15只。對照組不進行麻醉暴露；七氟醚暴露組：新生鼠放入保溫盒中，控制溫度在36 ℃，本研究模擬臨床麻醉狀態(tài)，采用三階段遞減濃度的七氟醚進行麻醉，首先，用3.5%七氟醚麻醉30 min，然后用3%七氟醚麻醉30 min，最后用2.5%七氟醚麻醉30 min，共1.5 h。麻醉期間用氣體分析儀監(jiān)測保溫盒內(nèi)二氧化碳和七氟醚濃度。麻醉結(jié)束后回籠，2月齡時進行后續(xù)的行為學等實驗。

1.2.2Morris水迷宮測試 水迷宮中加入二氧化鈦使水混濁，水溫控制在20 ℃。將小鼠從不同位置放入水池，記錄小鼠找到平臺的潛伏期，將平臺撤去，記錄小鼠穿越平臺的次數(shù)以及在平臺象限停留時間。

1.2.3三箱交互行為學測試 三箱裝置中每個側(cè)室均有一個圓形塑料籠，實驗包括四個階段，每次持續(xù)10 min。在第一階段，小鼠被限制在中間室；第二階段，允許小鼠自由探索；第三階段，在兩側(cè)的籠中分別放入陌生小鼠1及黑色立方體，允許小鼠探索10 min；第四階段，將黑色立方體替換成陌生小鼠2。記錄小鼠社交互動時間。

1.2.4關聯(lián)性恐懼與條件恐懼測試 在恐懼實驗中，小鼠被放入條件反射室中，用3 Hz頻率聲音刺激20 s和電刺激1 s，記錄小鼠聽到聲音時靜止次數(shù)。關聯(lián)性恐懼為將小鼠放入反射室中小鼠靜止次數(shù)。

1.2.5BDNF及Caspase-3免疫組化 鼠腦組織經(jīng)4% PFA固定、30%蔗糖脫水、石蠟包埋后5 μm切片，先用枸椽酸鈉高溫修復后，過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，之后以1 ∶200稀釋比例孵育Ⅰ抗體(BDNF及Caspase-3)，4 ℃過夜。次日，PBS洗滌后用HRP標記的二抗孵育1 h，之后用DAB顯色液顯影后顯微鏡拍照。利用Image J軟件對BDNF及Caspase-3的陽性細胞進行計數(shù)。

1.2.6全細胞膜片鉗記錄微小興奮性突觸后電流 小鼠斷頭取腦，預冷人工腦脊液灌注后振動機片機作300 μm海馬區(qū)域冠狀切面腦片，室溫恢復30 min后放入記錄箱，用人工腦脊液持續(xù)灌流，在顯微鏡下尋找海馬區(qū)GABA能神經(jīng)元。GABA能神經(jīng)元一般呈卵圓形，長軸約10 μm。并且通過兩種方法挑選出GABA能神經(jīng)元，首先，GABA能神經(jīng)元相對于其它神經(jīng)元有較小的膜電容及膜時間常數(shù)，其次，GABA能神經(jīng)元的微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic current, mEPSC)有更快的運動幅。將GABA能神經(jīng)元挑出，將細胞鉗制在-70 mV，并用300～400 pA電流刺激50 ms，記錄mEPSC峰值電流與頻率。

2 結(jié)果

2.1 小鼠在新生期七氟醚暴露可損傷青春期空間定位的記憶能力通過Morris水迷宮實驗研究小鼠在新生期七氟醚暴露對青春期(2月齡)空間定位的記憶能力的影響。對照組第1～5天小鼠尋找平臺的延遲時間(逃避潛伏期)分別為(78.79±9.25)、(31.25±3.56)、(18.67±5.12)、(13.24±4.56)和(18.12±4.78)s，七氟醚暴露組第1～5天小鼠逃避潛伏期分別為(82.36±2.56)、(67.84±7.52)、(58.79±5.44)、(48.24±1.49)和(43.24±3.14)s；與對照組比較，七氟醚暴露組第2～5天小鼠尋逃避潛伏期顯著增加(F=93.325，P<0.01)，見圖1A。與對照組(197.74±10.25)mm/s比較，七氟醚暴露組小鼠的游泳速度(209.36±11.23)mm/s，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.432，P=0.785)，見圖1B。與對照組(40.62±2.23)%比較，七氟醚暴露組小鼠在平臺象限的時間百分比(23.45±5.12)%顯著縮短(t=8.689，P<0.001)，見圖1C。與對照組(13.25±0.61)比較，七氟醚暴露組小鼠穿越平臺次數(shù)(6.16±0.84)顯著減少(t=11.372，P<0.001)，見圖1D。

圖1 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期空間定位的記憶能力

A：兩組小鼠的逃避潛伏期；B：兩組小鼠的平均游泳速度；C：兩組小鼠在平臺象限的時間百分比；D：兩組小鼠的穿越平臺次數(shù)；1.對照組; 2.七氟醚暴露組；與對照組比較：**P<0.01,***P<0.001

2.2 小鼠在新生期七氟醚暴露可損傷青春期恐懼記憶多次實驗中，與對照組比較，七氟醚暴露組小鼠條件性恐懼記憶曲線斜率顯著增加(P<0.05)，表現(xiàn)出更強的學習能力，見圖2A。但在單次實驗中，與對照組(48.36±5.23)%比較，七氟醚暴露組小鼠靜止次數(shù)百分比(32.14±3.76)%顯著降低(t=11.325，P<0.001)，表明小鼠的關聯(lián)性恐懼記憶減少，見圖2B；與對照組(83.24±6.36)%比較，七氟醚暴露組小鼠靜止次數(shù)百分比(57.35±5.43)%顯著降低(t=11.325，P<0.001)，表明條件性恐懼記憶降低，見圖2C。

圖2 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期

A：兩組小鼠多次實驗的條件性恐懼記憶斜率曲線；B：兩組小鼠單次實驗的關聯(lián)性恐懼記憶；C：兩組小鼠單次實驗的條件性恐懼記憶；與對照組比較：*P<0.05,***P<0.001

2.3 小鼠在新生期七氟醚暴露可損傷青春期社交記憶采用三箱實驗來檢測小鼠在新生期七氟醚暴露對青春期(2月齡)的社交記憶的影響。在陌生小鼠1-空籠實驗中，與空籠(50.23±4.36)s比較，七氟醚暴露組小鼠與陌生小鼠1社交互動時間(148.74±11.25)s明顯增加(圖3A、3B，t=9.654，P<0.001)；同樣，與空籠(54.76±7.28)s比較，對照組小鼠與陌生小鼠1社交互動時間(151.28±10.04)s明顯增加(圖3A、3B，t=10.344，P<0.001)，表明兩組在陌生小鼠1-空籠實驗中小鼠均無社交障礙。在陌生小鼠1-陌生小鼠2實驗中，七氟醚暴露組小鼠對陌生小鼠1(37.23±4.36)s與陌生小鼠2(40.35±2.16)s的社交互動時間無差異(圖3A、圖3C，t=0.664，P=0.753)；而對照組小鼠與陌生小鼠2的社交互動時間(88.16±7.34)s高于陌生小鼠1(35.38±4.28)s(圖3A、3C，t=12.932，P<0.001)，表明七氟醚可明顯損害小鼠的社交記憶。

圖3 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期社交記憶

A： 三箱實驗結(jié)果的示意圖；B：陌生小鼠1-空籠實驗中兩組小鼠的社交互動時間的統(tǒng)計結(jié)果，與陌生小鼠1比較：***P<0.001；C：陌生小鼠1-陌生小鼠2實驗中兩組小鼠的社交互動時間的統(tǒng)計結(jié)果；與陌生小鼠2比較：***P<0.001

2.4 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期海馬區(qū)域BDNF陽性細胞數(shù)目且增加凋亡細胞數(shù)目BDNF免疫組化染色結(jié)果(圖4A、4B)顯示，與對照組(100.00±9.32)%比較，七氟醚暴露組海馬組織中BDNF陽性細胞數(shù)百分比(44.28±5.14)%顯著降低(t=10.43，P<0.001)。Caspase-3免疫組化染色結(jié)果(圖4C、4D)顯示，與對照組(3.24±1.02)比較，七氟醚暴露組海馬組織單位mm2中Caspase-3陽性細胞數(shù)(35.42±4.71)顯著增加(t=16.533，P<0.001)。

2.5 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期海馬GABA能神經(jīng)元mEPSC的頻率與幅度通過全細胞記錄GABA能神經(jīng)元mEPSC(圖5A)，如圖5B所示，與對照組(4.34±0.26)Hz比較，七氟醚暴露組mEPSC頻率(2.78±0.31)Hz明顯降低(t=6.332，P<0.01)；如圖5C所示，與對照組(13.26±1.25)pA比較，七氟醚暴露組mEPSC的峰值電流(9.14±0.89)pA明顯降低(t=5.645，P<0.01)。

圖4 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期海馬區(qū)BDNF

A：兩組小鼠海馬區(qū)BDNF免疫組化標記代表圖；B：兩組BDNF陽性細胞的統(tǒng)計結(jié)果；C：兩組小鼠海馬區(qū)Caspase-3免疫組化標記代表圖；D：兩組海馬區(qū)Caspase-3陽性細胞的統(tǒng)計結(jié)果。與對照組比較：***P<0.001

3 討論

目前，雖然關于麻醉劑對神經(jīng)發(fā)育的研究結(jié)果存在爭議[3-6]，但麻醉劑暴露與神經(jīng)發(fā)育過程之間必然存在密切關系。在本研究中，小鼠在新生期七氟醚暴露可明顯損害其青春期的空間定位的記憶能力、恐懼記憶及社交記憶。本研究中，雖然七氟醚暴露的小鼠在條件性恐懼記憶過程中的學習能力增強，但這并不能表明新生鼠的七氟醚暴露與神經(jīng)損害之間無關聯(lián)。而既往研究[8]顯示七氟醚暴露造成條件性恐懼記憶過程中的學習能力減弱，這研究結(jié)果與本研究具有差異，造成結(jié)果差異的原因可能是既往研究[8]采用3%七氟醚麻醉新生鼠6 h，而本研究利用七氟醚濃度遞減模型模擬大部分臨床麻醉狀態(tài)，麻醉深度相對較淺。

圖5 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期GABA能神經(jīng)元mEPSC頻率與峰值電流

A：全細胞膜片鉗記錄兩組小鼠GABA能神經(jīng)元的mEPSC；B：兩組小鼠mEPSC頻率的統(tǒng)計結(jié)果；C：兩組小鼠mEPSC峰值電流的統(tǒng)計結(jié)果；與對照組比較：**P<0.01

本研究進一步對新生鼠七氟醚暴露對突觸可塑性的影響進行了探索。BDNF是腦內(nèi)重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在調(diào)控突觸可塑性過程中有重要作用，且與學習和記憶具有密切聯(lián)系[9]。有研究[10]表明，在神經(jīng)系統(tǒng)退行性病及發(fā)育障礙的小鼠模型中BDNF明顯下降。麻醉藥物可引起的術后認知障礙，而激活BDNF的翻譯能逆轉(zhuǎn)這種認知障礙[11]。本研究結(jié)果顯示，七氟醚可明顯抑制海馬神經(jīng)元BDNF表達。Caspase-3在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙中起重要作用，且有研究[12]表明神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的小鼠神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞中Caspase-3表達升高。另外，已有研究[13]表明，新生鼠七氟醚暴露可抑制海馬及杏仁核神經(jīng)元再生，且可誘導海馬及皮層的神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果顯示，七氟醚可明顯促進海馬神經(jīng)元Caspase-3表達。因此，本研究證實了七氟醚對新生鼠的海馬神經(jīng)元的損害作用。神經(jīng)元功能障礙一般表現(xiàn)為mEPSC的頻率與幅度的降低[14]。而本研究結(jié)果表明新生鼠七氟醚暴露可明顯降低GABA能神經(jīng)元mEPSP的頻率及幅度。