程 歡，蘇 蓋，陶思躍，尤 濤

干細(xì)胞是具有良好的增殖、自我復(fù)制能力以及多向分化潛能的一類細(xì)胞，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)科學(xué)研究，甚至于臨床治療。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyma stem cells，MSCs)具有免疫源性低，來源豐富，具備免疫調(diào)理特性，得到特別的重視，是現(xiàn)在研究最為廣泛的干細(xì)胞之一[1]?，F(xiàn)在越來越多的研究認(rèn)為，MSCs的治療與其外分泌功能密切相關(guān)[2]。外泌體是MSCs外分泌的主要成分之一，所以MSCs外泌體的獲取是研究MSCs外分泌的“無細(xì)胞治療”效應(yīng)及機(jī)制的必要基礎(chǔ)條件。小鼠因具有價(jià)格低廉、易于飼養(yǎng)及有多種基因型等特點(diǎn)，在基礎(chǔ)科學(xué)研究中得以廣泛應(yīng)用[3]；但小鼠MSCs量極少、存活率低，其培養(yǎng)異常困難，也使得小鼠MSCs外泌體的獲取也變得相當(dāng)困難。該研究在總結(jié)以前方法的基礎(chǔ)上應(yīng)用全骨髓、差速貼壁并輔助以低氧環(huán)境的培養(yǎng)方法進(jìn)行了小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)的培養(yǎng)，并對其進(jìn)行外泌體提取和檢測，希望可以發(fā)現(xiàn)小鼠MSCs穩(wěn)定、高效的培養(yǎng)以及有效提取外泌體的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～8周齡SPF級(jí)C57 BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量15～20 g，共8只，SPF級(jí)飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑 MesenCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含谷氨酰胺，不含青霉素、鏈霉素，STEMCELL TECHNOLOGIES,Cat.NO.05514)；MesenCultTM10×添加物(STEMCELL TECHNOLOGIES, Cat. NO.05515)；MesenPureTM 1000×(STEMCELL TECHNOLOGIES, Cat. NO.05500)；0.25%胰酶/0.02% EDTA(BI Biological Industries Cat. NO.03055-1A)；GlutaMAXTM 添加劑100×(Gibco Cat.NO.35050061)；青鏈霉素 (SIGMA Cat.NO.V900929)；PBS (上海生工 Cat.NO.BN40100-0500); FBS(BI Biological Industries); EDTA(0.5 mol/L, pH8.0, Thermo Scientific Cat.NO. R1021)；IBMX(MedChemExpress)。

1.1.3主要儀器 超凈工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)(Thermo Scientific)，細(xì)胞培養(yǎng)缺氧小室(STEMCELL TECHNOLOGIES)，減壓閥(有流量控制器)(上海減壓器廠有限公司)，70 μm細(xì)胞篩、50 ml離心管、100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(BI Biological Industries)。

1.3 小鼠BM-MSCs的分離和培養(yǎng)[4]頸椎脫臼法處死小鼠，酒精浸泡后剝離出股骨和脛骨，組織鑷去除殘存軟組織；剝離完全后切除股骨上1/3，將所得的股骨和脛骨置于研缽內(nèi)，并加入適量分離buffer。杵輕輕按壓破壞骨髓腔，使細(xì)胞流出，再通過細(xì)胞篩收集細(xì)胞；反復(fù)清洗，直到骨髓腔變白。1 000 r/min離心含有骨髓細(xì)胞的懸液5 min；去除上清液，重懸細(xì)胞沉淀。取出細(xì)胞，加入等量臺(tái)盼藍(lán)，混勻后將10 ml全骨髓細(xì)胞鋪在100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿置于充滿低氧混合氣(5% O2，10% CO2，85% N2)的缺氧小室后，將其置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)3～4 d后打開缺氧小室，觀察MSCs如果細(xì)胞貼壁成簇生長達(dá)到80%即可進(jìn)行傳代工作；如果沒有達(dá)到80%，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d。傳代：PBS清洗，胰酶消化。加入完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，去除上清液加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，1 ∶2進(jìn)行傳代。2～3 d后，細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上可再次傳代。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定BM-MSCs表面標(biāo)志物用流式細(xì)胞緩沖液重懸細(xì)胞。 取細(xì)胞懸液至EP管中，每管加入一抗，混勻。2～8 ℃孵育30 min后用流式細(xì)胞緩沖液清洗樣品。1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，每組各加入流式細(xì)胞緩沖液重懸。每組各加入熒光二抗，重懸細(xì)胞，2～8 ℃，避光孵育30 min后，用流式細(xì)胞緩沖液清洗樣品3次后，用500 μl流式細(xì)胞緩沖液重懸細(xì)胞，等待上機(jī)檢測。

1.5 BM-MSCs誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)[5]

1.5.1成骨誘導(dǎo)分化 成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：89%α-MEM+10% FBS+1%雙抗+50 μmol/L 抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+100 nmol/L地塞米松。在6孔板每孔中加入1 ml促貼壁因子，放入37 ℃培養(yǎng)箱30 min后吸走促貼壁因子，晾干后，將小鼠BM-MSCs接種到6孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基，置于缺氧小室培養(yǎng)2～3 d后更換成成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基， 3～4周后觀察細(xì)胞完全長滿皿底，終止誘導(dǎo)分化。洗滌后，每孔加入2 ml 4%多聚甲醛，室溫固定15 min；PBS洗滌，每孔加入茜素紅染液染色5 min；顯微鏡下觀察成骨效率。

1.5.2成脂肪誘導(dǎo)分化 配制成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(誘導(dǎo)液)：89%高糖(HG)DMEM+10% FBS+1%雙抗+10 μg/ml胰島素+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L IBMX+1 μmol/L地塞米松。配制成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(維持液)：89% HG-DMEM+10% FBS+1%雙抗+10 μg/ml胰島素。將小鼠BM-MSCs接種到6孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基，于缺氧小室培養(yǎng)2～3 d后更換成成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，3 d后更換成成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，24 h后再換回誘導(dǎo)液，反復(fù)4次，用維持液培養(yǎng)4～7 d。多聚甲醛固定后每孔中加入1 ml油紅O染料液染色，于倒置顯微鏡下觀察成脂肪效率。

1.5.3成軟骨誘導(dǎo)分化 配制成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：89% HG-DMEM+1%雙抗+10%轉(zhuǎn)鐵蛋白100 nmol/L地塞米松+1 μmol/L 抗壞血酸+1%丙酮酸鈉+1%脯氨酸+10 ng/mlTGF-β3。小鼠BM-MSCs接種到96孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基，于缺氧小室培養(yǎng)1～2 d后，換成成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基， 3～4 d更換1次，持續(xù)3～4周。4%多聚甲醛固定30～60 min，然后加入200 μl 1%阿利辛藍(lán)染色過夜，于倒置顯微鏡下觀察成軟骨效率。

1.6 小鼠BM-MSCs的外泌體提取與鑒定[6]將小鼠BM-MSCs擴(kuò)增至第5代后，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d，隨后將10% MesenCultTM10×添加物更換成10% Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum，低氧繼續(xù)培養(yǎng)2 d。傳下一代時(shí)收集上清液，置于-80 ℃保存。將收集的細(xì)胞上清液用水平轉(zhuǎn)子去除死細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大的細(xì)胞污染物；再次收集細(xì)胞上清液，置于超速離心管內(nèi)30 000 r/min超速離心2 h；棄上清液，重懸外泌體沉淀，再次30 000 r/min 超速離心2 h后，500 μl PBS重懸外泌體沉淀。上透視電鏡拍照、成像。采用Western blot鑒定外泌體表面陽性蛋白特異性標(biāo)志物HSP70、Syntenin1、CD9、CD63、TSG101及陰性蛋白標(biāo)志物Grp94。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BM-MSCs的分離和培養(yǎng)該方法培養(yǎng)的小鼠BM-MSCs生長狀態(tài)好、穩(wěn)定、高效，第三代細(xì)胞就可達(dá)到95%以上的純度且可穩(wěn)定傳代至15代左右。見圖1。

2.2 流式細(xì)胞儀鑒定BM-MSCs表面標(biāo)志物培養(yǎng)出來的BM-MSCs不表達(dá)細(xì)胞抗原CD117和細(xì)胞抗原CD31，而表達(dá)了整合素家族類抗原標(biāo)志分子CD29、黏附分子家族類抗原標(biāo)志分子CD44和Ly-6抗原家族成員Sca-1，見圖2。

中性點(diǎn)套管采用鋼壓塊壓接瓷套的固定方式，在變壓器抽真空期間，油箱頂部變形較大，變形產(chǎn)生的應(yīng)力通過鋼制壓板直接作用在套管的瓷套上，超過瓷套的機(jī)械強(qiáng)度后將導(dǎo)致其出現(xiàn)裂紋，甚至斷裂。

2.3 BM-MSCs誘導(dǎo)分化結(jié)果

2.3.1成骨誘導(dǎo)分化 細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)槎嘟切?，?xì)胞呈多層性、重疊性排列，形成間質(zhì)內(nèi)含大量礦鹽沉積的鈣化結(jié)節(jié)。茜素紅S染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)紅色，見圖3A。

2.3.2成脂肪誘導(dǎo)分化 誘導(dǎo)而成的脂肪細(xì)胞累積脂質(zhì)，脂滴變大并合并呈串珠狀。經(jīng)油紅O染色呈鮮紅色，見圖3B。

2.3.3成軟骨誘導(dǎo)分化 多數(shù)細(xì)胞變成多邊形,核周顆粒密集排布,部分細(xì)胞邊界不清,呈圓形,核偏位,核周顆粒明顯，經(jīng)阿利辛藍(lán)染色后，在軟骨細(xì)胞周圍可見到藍(lán)染的酸性蛋白聚糖，見圖3C。

2.4 小鼠BM-MSCs外泌體的電鏡觀察及標(biāo)志物檢測電鏡下觀察到外泌體典型的杯口狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)Western blot結(jié)果顯示HSP70、Syntenin1、CD9、CD63及TSG101都是陽性，而Grp94只存在于BM-MSCs內(nèi)，不存在于外泌體內(nèi)，見圖4。

A：第1次換液后MSCs鏡下成像；B：第1次傳代前MSCs鏡下成像；C：第1次傳代后MSCs鏡下成像；D：第10代MSCs鏡下成像

圖2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定BM-MSCs表面標(biāo)志物

A：CD117檢測; B:CD31檢測; C:CD44檢測; D:CD29檢測; E:Sca-1檢測

圖3 BM-MSCs誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn) ×100

圖4 小鼠BM-MSCs外泌體的提取與鑒定

A：電鏡下觀察到外泌體典型的杯口狀結(jié)構(gòu)×100 000；B：外泌體標(biāo)志物的檢測

3 討論

MSCs是最為常見的干細(xì)胞之一，其主要存在于骨髓組織中，具有分化成多種結(jié)締組織細(xì)胞的潛能[1]。人們從骨、脂肪、臍血等多種組織中成功分離培養(yǎng)出MSCs, 但目前從骨髓中分離培養(yǎng)仍為獲取MSCs的最主要方法[4]。BM-MSCs具有病原微生物感染率低、生物性能穩(wěn)定、低免疫原性及移植免疫排斥反應(yīng)弱等特性，且可為諸如骨及軟骨損傷中組織再生修復(fù)提供了很好的材料[7]。BM-MSCs在造血、心肌梗死或關(guān)節(jié)疾病患者中的有效性在臨床上已得到充分證明。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中的BM-MSCs常來源于大鼠、兔、狗等形體較大動(dòng)物，但它們具有不便于飼養(yǎng)、價(jià)格較高、繁殖較慢以及缺乏基因型的缺點(diǎn)。小鼠的基因與人的基因相似度近99%，且較大鼠及其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而言，具有形體較小、飼養(yǎng)方便、易于管理、價(jià)格低廉、生產(chǎn)繁殖及成熟快，尤其是具有諸多基因型等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)代基礎(chǔ)研究中必不可少的，最為常見的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。此外，成功培養(yǎng)后的BM-MSCs具有干細(xì)胞特性穩(wěn)定、傳代次數(shù)多，可達(dá)10代以上等優(yōu)勢。雖然目前已有一些成功培養(yǎng)小鼠BM-MSCs的報(bào)道[8]，但是由于小鼠骨髓腔細(xì)短，間充質(zhì)細(xì)胞和非間充質(zhì)細(xì)胞的“復(fù)合物”隱藏于緊密的骨內(nèi)膜中[9]，難以釋放出來；而且小鼠骨髓間充質(zhì)的含量也非常低，僅為0.001%～0.01%[10]，所以在實(shí)際操作中想要從小鼠骨髓中穩(wěn)定、高效的獲取濃度和純度相對較高的MSCs仍然較為困難。本研究采用研缽和杵壓碎骨髓腔及細(xì)胞篩過濾方法，使得小鼠BM-MSCs充分溶解釋放，大大提高了初始培養(yǎng)階段的MSCs濃度及純度。然后根據(jù)小鼠的BM-MSCs較其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的BM-MSCs傳代的潛伏期要長的特點(diǎn)，延長初次的培養(yǎng)時(shí)間至5 d以上[11]；此外，根據(jù)常規(guī)培養(yǎng)條件下，小鼠的BM-MSCs會(huì)逐漸失去增殖分化能力[12]的特點(diǎn)，使用專用的培養(yǎng)基和特殊的添加物，并放置在5%氧濃度的低氧環(huán)境下培養(yǎng)，更有利于BM-MSCs的增殖分化[13]。這種全骨髓、差速貼壁及低氧環(huán)境培養(yǎng)方法可以使得小鼠BM-MSCs的增殖速度加快，純度更高，甚至傳至15代仍然保持干細(xì)胞的活力。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示此方法培養(yǎng)的小鼠BM-MSCs可很好的誘導(dǎo)成骨、成脂肪及成軟骨，證實(shí)了其具有良好的分化能力。符合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的要求，可以應(yīng)用于MSCs相關(guān)的研究。

MSCs可以產(chǎn)生大量豐富的生長因子和細(xì)胞因子，越來越多的研究顯示MSCs是通過其外分泌的無細(xì)胞治療效應(yīng)，發(fā)揮其功能的，這減輕了免疫源性，避免了干細(xì)胞成瘤性等缺點(diǎn)。外泌體是一類大小約50～200 μm的，由細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡，其可以攜帶多種活性蛋白，非編碼RNA等物質(zhì)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊；它可促進(jìn)很多疾病的發(fā)生及發(fā)展，又可作為疾病生物標(biāo)志物，同時(shí)對疾病也具備治療潛力[14]。外泌體是MSCs外分泌的主要成分之一，被認(rèn)為是MSCs旁分泌的無細(xì)胞(cell-free)治療最重要的機(jī)制之一[15]。對其研究有利于進(jìn)一步闡明MSCs的無細(xì)胞治療的理論及機(jī)制，是當(dāng)今的熱點(diǎn)。正如上所述，小鼠MSCs的培養(yǎng)極其困難，制約了它的外泌體的獲?。坏耐饷隗w又是基礎(chǔ)研究中不可缺少的材料。本研究通過“全骨髓、差速貼壁及低氧方法”成功培養(yǎng)小鼠BM-MSCs的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其經(jīng)過5代培養(yǎng)后，可自然分泌出外泌體，超速離心可得到符合實(shí)驗(yàn)條件的外泌體。Western blot結(jié)果顯示外泌體的蛋白標(biāo)志物：特異性的標(biāo)志物 HSP70、Syntenin1、CD9、CD63及TSG101為陽性；排除標(biāo)志物 Grp94為陰性。透視電鏡見典型的外泌體樣結(jié)構(gòu)(通茶托型、一側(cè)凹陷的半球形)符合外泌體的特征。所以可以認(rèn)為應(yīng)用此方法培養(yǎng)出的小鼠BM-MSCs可更穩(wěn)定的自然分泌外泌體，且易于提取。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)所用的小鼠為C57 BL/6小鼠，其他品系小鼠能否獲得如此效果需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究建立了一種穩(wěn)定、高效的小鼠BM-MSCs培養(yǎng)方法，為MSCs的功能機(jī)制研究提供了良好的種子細(xì)胞；同時(shí)驗(yàn)證了用此方法培養(yǎng)的小鼠BM-MSCs能穩(wěn)定、高效的自然分泌外泌體，且易于提取，為MSCs的無細(xì)胞的外泌體治療的深入研究提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。