葉愛琴

（溫州市中醫(yī)院藥劑科，浙江溫州325000）

復合維生素B片是由維生素B13mg、維生素B21.5mg、煙酰胺10mg、維生素B60.2mg與右旋泛酸鈣1mg組成的復方制劑，是一種維生素類非處方藥，用于預防和治療B族維生素缺乏所致的營養(yǎng)不良、厭食、腳氣病、糙皮病等，其現(xiàn)行標準是原衛(wèi)生部藥典委員會制定的藥品標準—化學藥品及制劑（第一冊），國外標準中未收載有相同處方的制劑。復合維生素B片作為一種口服固體制劑，現(xiàn)行標準中并沒有溶出度的檢查項目[1]，僅有崩解時限項目，有文獻報道了復合維生素B片溶出度的研究[2]，但采用的是紫外分光光度法，方法準確性的專屬性有待考察，溶出度測定結果是否能反映不同廠家產品的差異還值得探討。本研究采用HPLC法建立了新的溶出度測定方法，不僅對處方中難溶性的維生素B2成分進行溶出度的測定，對不同轉速、不同溶出介質的影響進行了考察，對55批樣品的溶出度進行了測定，并對國內8個生產廠家的產品進行溶出曲線的考察，方法簡便可靠，區(qū)分力強，能夠為質量標準的提高和產品質量的評價提供實驗依據(jù)。

1 材料

708DS型溶出度儀（配備850-DS取樣收集系統(tǒng)，美國Agilent公司），Agilent1200 高效液相色譜儀（美國Agilent公司，包括紫外檢測器、自動進樣器和Chemstation色譜工作站），CPA225D型電子天平（德國賽多利斯公司，十萬分之一）。維生素B2對照品（批號：100369-201504，含量98.2%，中國食品藥品檢定研究院提供），8批復合維生素B片樣品均為質量考核抽樣樣品，規(guī)格：復方制劑，每片含維生素B13mg、維生素B21.5mg、維生素B60.2mg、煙酰胺10mg、右旋泛酸鈣1mg（廠家a：批號18010601；廠家b：批號171004；廠家c：批號1709241；廠家d：批號20170902；廠家e：批號161105；廠家f：批號171205；廠家g：批號2171002；廠家h：批號1612006）；水為純化水，磷酸二氫銨、磷酸為分析純，庚烷磺酸鈉、乙腈為色譜純。

2 方法和結果

2.1 溶出度考察對象的選擇 復合維生素B片所含的5個藥物組分中維生素B1、維生素B6、煙酰胺、泛酸鈣4個成分均在水中易溶，而維生素B2在水中極微溶解，即可得知本品溶出度結果取決于維生素B2這一難溶性成分的溶出情況，同時根據(jù)國家藥品標準技術規(guī)范[3]的要求，復方制劑的溶出度應重點針對在水中微溶或不溶的活性成分，因此本研究選擇維生素B2為溶出度測定的對象。

2.2 溶液的制備 維生素B2對照品溶液：精密稱取維生素B2對照品適量，以水為溶劑加熱振搖使維生素B2溶解并稀釋制成約50μg/mL的溶液作為維生素B2對照品儲備液，精密移取維生素B2對照品儲備液5mL，置100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。溶出介質：①pH值1.2的緩沖液（取鹽酸4.59mL加水稀釋至1000mL）；②pH值4.3的緩沖液（中國藥典2015年版維生素B2片溶出度方法，以冰醋酸3mL與4%氫氧化鈉溶液18mL用水稀釋至600mL）[4]；③pH值6.8的緩沖液（取150mL0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液與67.2mL0.2mol/L氫氧化鈉溶液混合后，再加水稀釋至600mL，搖勻）；④水[美國藥典USP39版RiboflavinTablets（維生素B2片）溶出度方法]。供試品溶液：精密稱取樣品細粉適量（相當于維生素B20.5mg）置200mL量瓶中，加水約150mL超聲處理15min，使維生素B2溶解，稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液。

2.3 溶出度測定方法的建立與驗證

2.3.1 色譜條件：色譜柱：使用CAPCellPAKC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以含2mmol/L庚烷磺酸鈉、50mmol/L磷酸二氫銨的溶液（取庚烷磺酸鈉0.404g和磷酸二氫銨5.75g加水至1000mL，攪拌使溶解，用磷酸調節(jié)pH值至3.0）-乙腈（85：15）為流動相；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：267nm；進樣量：20μL。在本色譜條件下，輔料對測定無干擾，維生素B2峰的保留時間為8.3min，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.2 儀器精密度：取維生素B2對照品溶液連續(xù)進樣6針，測得維生素B2峰面積的RSD為0.04%。

2.3.3 定量限：取維生素B2對照品溶液用水不斷稀釋并進樣測定，當S/N為10左右時測得維生素B2的定量限濃度為0.01μg/mL。

2.3.4 線性關系考察：精密量取維生素B2對照品儲備液25mL置于50mL量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻，精密量取該溶液0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0、6.0、10.0mL分別置50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為維生素B2線性考察用測定溶液。取上述線性測定溶液進樣測定，分別以峰面積A為縱坐標，以濃度C為橫坐標，得到回歸方程為A=96.267C-0.274，r=0.9999。由此可知，維生素B2在0.126～5.023μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.5 重復性試驗：精密稱取樣品（廠家c，批號1709261）細粉適量（相當于維生素B20.5mg）置200mL量瓶中，加水約150mL超聲處理15min，使維生素B2溶解，稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。同法配制6份溶液，分別進樣測定，計算平均含量為96.2%，RSD為0.8%。

2.3.6 回收率試驗：精密稱取已知含量的樣品（廠家c，批號1709261）細粉適量（相當于維生素B20.25mg）9份，分別置250mL量瓶中，各精密加入維生素B2對照品貯備液1.25mL、5.0mL、7.5mL各3份，再加溶出介質約150mL超聲15min使維生素B2溶解，放冷，稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液分別作為50%、80%、100%供試溶液，每個濃度各制備3份溶液，分別進樣測定，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果

2.3.7 溶液穩(wěn)定性：在避光操作條件下，按2.2.5項下的方法采用溶出介質配制供試品溶液1份，分別放置0、1、2、4、6、8、10、12、24h后進樣考察供試品溶液的穩(wěn)定性，計算得出維生素B2峰面積的RSD為0.3%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定。

2.4 溶解度試驗 因維生素B2在水中溶解度極低，因此有必要考察其在不同pH溶出介質中的溶解度情況。稱取維生素B2原料（上海阿拉丁公司，純度＞98%）4份，各約0.1g分別置于錐形瓶中，分別精密加入100mLpH1.2、pH4.3、pH6.8的緩沖溶液和水，密塞，避光置于恒溫振蕩器中回旋振蕩24h（恒溫溫度37℃，轉速150r/min）。取出后迅速過濾，精密取續(xù)濾液5mL分別置于100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，進樣測定，計算溶解度結果見表2。

表2 維生素B2在37℃時不同介質中的溶解度（μg/mL）

2.5 溶出方法的確定和溶出曲線比較

2.5.1 試驗裝置和溶出體積的選擇：本實驗選擇維生素B2作為溶出度測定的對象。參考國內外維生素B2片的溶出度方法，美國藥典USP40版Ribofla-vinTablets（維生素B2片）和中國藥典2015 年版維生素B2片均采用槳法進行溶出度的檢查，又因本品為普通片劑，故選擇槳法進行溶出度測定。維生素B237℃在不同pH值緩沖溶液中的溶解度均約為0.1mg/mL，按本品的規(guī)格（每片含維生素B21.5mg）計算，采用體積為100mL的溶出介質（全部溶解時的濃度約為0.015mg/mL）即可完全滿足漏槽條件，同時，結合維生素B2HPLC測定方法的靈敏度，選擇溶出介質的體積為600mL既能滿足漏槽條件，又能適當提高靈敏度。

2.5.2 轉速的選擇：采用槳法考察轉速的影響，取樣品（廠家c，批號1709261），采用pH值1.2的緩沖液為溶出介質，體積600mL，分別以50、75r/min的轉速進行溶出試驗，在5、10、15、20、30、45、60、90min取樣，濾過，同時補充溶出介質，取續(xù)濾液作為供試品溶液按上述色譜條件進行測定，繪制溶出曲線（見圖2），結果顯示，轉速為50r/min時，溶出曲線上各點的累積溶出量均小于轉速為75r/min的累積溶出量，而到達平臺期后直至90min并沒有再繼續(xù)溶出，溶出曲線沒有與轉速為75r/min的溶出曲線相交，說明還有部分樣品沒有溶出，50r/min的轉速不足以使片劑中維生素B2全部溶出。另外取另一個廠家的樣品（廠家b，批號171004）進行試驗，同法進行試驗也得出相同的結論。因此，本方法選擇轉速為75r/min。

圖2 不同轉速的溶出曲線（廠家c，批號1709261）

2.5.3 溶出介質的確定：取樣品（廠家c，批號1709261），采用槳法，轉速為75r/min，體積600mL，分別在pH1.2、pH4.3、pH6.8的緩沖液和水4種溶出介質中進行溶出試驗，按照2.5.2 的方法測定溶出曲線，結果見圖3。根據(jù)圖中的溶出曲線情況可知，轉速為75r/min時在4種不同pH的溶出介質中，兩批樣品30min時溶出曲線均能達到90%以上，各點溶出量均比較接近，溶出曲線大致比較相似。另外，根據(jù)前述溶解度試驗結果，維生素B2在這4種溶出介質中的溶解度相差不大，可以忽略，如采用水為溶出介質，省去配制過程，使實驗過程更方便快捷，USP41版維生素B2片的方法亦采用水為溶出介質。綜合上述情況，考慮選擇水作為溶出介質。

2.5.4 取樣時間的確定：根據(jù)上述各種溶出介質的溶出曲線，30min時已達到平臺期，之后樣品的累積溶出量變化不大，綜合考慮，故確定取樣時間為30min。

2.5.5 管路吸附考察：取以水為溶出介質的溶出液，在溶出曲線取樣最后一個點時分別進行手動取樣和儀器自動取樣，結果手動取樣和儀器自動取樣得到樣品的峰面積一致，表明溶出儀對維生素B2無吸附。

圖3 不同溶出介質的溶出曲線（廠家c，批號1709261）

圖4 不同廠家樣品的溶出曲線

2.5.6 溶出曲線考察：采用中國藥典2015年版四部通則中規(guī)定的槳法，以900mL鹽酸溶液（稀鹽酸24mL，加水至1000mL）為溶出介質，轉速為50r/min，取8個廠家各1批樣品，按2.3.3的方法測得溶出曲線，結果見圖4。

3 討論

3.1 維生素B2濃度測定方法的確定 復合維生素B片含有5 個組分，因此在本研究之前建立了采用HPLC梯度洗脫同時測定5個成分的含量測定方法。因本品溶出度只需考察維生素B2，因此在上述含量測定方法的基礎上，改變流動相的比例，加快其他組分的快速洗脫，建立了維生素B2溶出度的測定方法，因此其他4個組分及輔料均對維生素B2無干擾，經過驗證，準確度、精密度及靈敏度均符合溶出度測定的要求。本品1片中均含維生素B2僅1.5mg，如采用紫外可見分光光度法測定，輔料或其他組分會產生一定的本底吸收，會對測定結果產生一定的干擾，同時經試驗研究表明，原標準中的含量測定方法采用分光光度法于444nm處測定維生素B2的含量，影響因素多，測定結果偏差大，不能準確反映樣品的真實含量。試驗結果顯示維生素B2水溶液在224、267、375、444nm處均有最大吸收，DAD檢測結果顯示不管在什么波長處檢測，HPLC法均可以使維生素B2與輔料得到分離，檢測無干擾，但4個波長中267nm處的吸光度最大，是375nm和444nm處的吸光度的3倍以上，靈敏度最高，因此選擇267nm作為檢測波長。與文獻[2]的研究相比，本研究中的HPLC法專屬性更好，不受輔料及其他組分的干擾，測定結果會更準確。本方法中在避光操作條件下，供試品溶液中維生素B2在24h內均較穩(wěn)定，說明方法的耐用性也較好，適合溶出度的測定。

3.2 關于參比制劑的問題及轉速和溶出介質的選擇 復方維生素B片為復方制劑，國內外均無法找到本品的原研制劑。因本研究中的方法只考察維生素B2這個難溶性組分的溶出情況，因此嘗試選用維生素B2的單方原研片劑-維生素B2片作為參比制劑。然而一是維生素B2原研片難以獲取，二則是對于維生素B2片，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心在2017年12月9日發(fā)布的《289目錄品種參比制劑基本情況表》中已明確“不推薦參比制劑”，原因是維生素B2片在FDA被列為OTC專論中的活性成分，橙皮書中未有收載[5]，因此本研究中沒有選擇參比制劑進行溶出方法的研究。

在本研究溶出方法的建立過程中，因沒有合適的原研制劑作為參比制劑，所以選擇了抽樣樣品中相對來說在國內比較知名的、市場占有率較高的品牌的產品來進行轉速和溶出介質的考察，對4種不同pH值溶出介質均進行了考察，以提高溶出方法的可靠性。

3.3 結果和建議 根據(jù)溶出曲線考察結果顯示，8個樣品的溶出曲線差異明顯：①廠家b樣品的溶出最快，15min溶出達到90%；②廠家a、廠家c、廠家e和廠家f4個廠家樣品的溶出曲線比較接近，30min時的溶出量均達到75%以上，只是廠家a和f前期溶出速率稍慢；③廠家d、廠家g、廠家h3個廠家的樣品前期溶出緩慢，30min溶出量均在60%及以下，溶出速率較其他5個廠家的樣品明顯偏慢，其中廠家g的樣品前期溶出較慢，但隨著時間推移溶出越來越快，而廠家h的樣品整個溶出過程溶出速率均較慢，90min時的溶出量仍不到80%，無法達到釋放平臺。此外，筆者還根據(jù)建立的溶出度方法對8個廠家的27批次樣品的溶出度進行了檢查，以75%為限度，結果顯示有5個廠家共計7批次樣品溶出度不合格。由于無法確定原研廠家及原研制劑，各廠家產品的溶出曲線好壞也無法準確評判，有待進一步研究，但復合維生素B片為普通崩解型速釋片劑，廠家d、廠家g、廠家h3個廠家的產品30min溶出量均在60%及以下，與其他5個廠家的藥品相比，溶出明顯偏慢，說明這些廠家藥品的制劑處方及工藝相對其他廠家來說存在一些問題，這些廠家應加強對藥品的制劑處方、原輔料、工藝的研究以及對溶出度進行研究，以提高藥品的有效性。