張紅素 馮梅

急性心肌梗死則是導(dǎo)致冠心病患者猝死的主要原因，在心肌恢復(fù)血流灌注后，可能導(dǎo)致心肌進(jìn)一步受損，表現(xiàn)為心肌頓抑、及再灌注性心律失常，這種現(xiàn)象被稱為心肌缺血-再灌注損傷(MIRI)[1]。研究表明，MIRI病理進(jìn)展與細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激損傷、炎性反應(yīng)激活、心肌細(xì)胞凋亡等有關(guān)[2]。Akt/eNOS信號通路MIRI后心肌細(xì)胞的保護(hù)通路之一，主要通過Akt的磷酸化發(fā)揮心肌細(xì)胞抗凋亡作用[3]。研究表明，MIRI時Akt磷酸化水平提高可誘導(dǎo)eNOS產(chǎn)生進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，eNOS的高表達(dá)可防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載、調(diào)節(jié)心肌血流，抑制血管痙攣、減少炎性細(xì)胞浸潤等環(huán)節(jié)[4,5]。蘆薈苷(Barbaloin,BAR)，作為蘆薈的重要活性物質(zhì)，是從蘆薈中提取得到的蒽醌類化合物，既往研究顯示，BAR可能通過激活A(yù)MPK信號通路抑制心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡[6]。本研究探索BAR預(yù)處理對于MIRI時心肌氧化應(yīng)激水平、心肌細(xì)胞凋亡及Akt/eNOS信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12周齡SPF級雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量200～230 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號：0016759。

1.2 藥品與試劑 蘆薈苷(北京貝爾蘭科生物科技有限公司提供，批號：110787)；地爾硫卓(河南省國藥醫(yī)藥有限公司，批號：42399-41-7)；戊巴比妥鈉(Bio-Rad公司)；0.9%氯化鈉注射液(安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)；大鼠一氧化氮(NO)及總抗氧化能力(TAOC)化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒(Thermo Fisher公司，批號：S0023；S0121)；大鼠丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px) Elisa試劑盒(南京建成生物科技有限公司提供)；Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)；山羊抗大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)及磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)抗體，小鼠抗大鼠蛋白激酶B(Akt)抗體及磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體(Abcam公司)；小鼠抗山羊及兔抗小鼠二抗(中衫金橋)；DAB顯色劑(Solarbio公司)。

1.3 儀器 大鼠TOPO呼吸機(jī)(贊德儀器有限公司)； 酶標(biāo)儀(BioTek Epoch，美國伯騰儀器有限公司)；Attune NxT流式細(xì)胞儀(Thermo Fisher公司)；電泳儀(Bio-Rad，美國伯樂公司)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendor-5810R，德國艾本德股份公司)；Olympus BX53導(dǎo)致熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物模型的制作：大鼠稱重后經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉。氣管插管連接TOPO大鼠呼吸機(jī)。連接多導(dǎo)生理記錄儀，監(jiān)測心電圖及心率。備皮并消毒后，于左側(cè)第3～4肋間，行開胸術(shù)，開瞼器撐開，暴露心臟，在其下2 mm處，用6-0縫線結(jié)扎左冠狀動脈前降支。心電圖顯示ST段弓背型抬高，維持30 min后解除結(jié)扎線，使左冠狀動脈前降支恢復(fù)血流灌注，心電圖顯示ST段緩慢下移，表明再灌注成功。關(guān)閉胸腔，持續(xù)再灌注60 min后檢測相關(guān)實驗指標(biāo)。

1.4.2 實驗分組：72只SD大鼠隨機(jī)分為6組，對照組，模型組，陽性對照組(地爾硫卓 0.01 mg/kg)，BAR低濃度預(yù)處理組(10 mg/kg)，BAR中濃度預(yù)處理組(50 mg/kg)和BAR高濃度預(yù)處理組(100 mg/kg)，每組12只。對照組大鼠麻醉后行開胸術(shù)，分離左前降支但不結(jié)扎，模型組于心肌缺血前1周給與同體積 0.9%氯化鈉溶液腹腔注射1周，1次/d，再制作缺血再灌注模型，陽性對照組利用地爾硫卓 0.01 mg/kg連續(xù)灌胃一周，1次/d，后制作缺血再灌注模型，BAR低、中、高濃度預(yù)處理組于心肌缺血前1周給予10、50、100 mg/kg BAR腹腔注射，1次/d，持續(xù)1周，后行缺血/再灌注術(shù)。

1.4.3 血清及心肌組織氧化應(yīng)激水平的檢測：缺血/再灌注60 min后立即取各組大鼠腹主動脈血5 ml及心肌組織，按照化學(xué)定量檢測試劑盒及Elisa說明書對NO、TAOC水平以及MDA、SOD、CAT、GSH-px含量進(jìn)行檢測。

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率：缺血/再灌注60 min后立即取各組大鼠心肌組織，充分剪碎，300目銅網(wǎng)過濾制成細(xì)胞懸液，調(diào)整各管的細(xì)胞數(shù)約為1×109/L，再取心肌細(xì)胞5×105個，以PBS液清洗，500 r/min 離心1 min，沉淀肺細(xì)胞，棄去上清液，加入結(jié)合緩沖液195 μl，懸浮肺細(xì)胞，加入Annexin V 5 μl，混勻后避光放置10 min，然后PBS液清洗，500 r/min離心1 min，沉淀肺細(xì)胞，以190 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μl碘化丙啶(PI)，混勻后上機(jī)，行流式細(xì)胞術(shù)檢測，用CellQuest Pro 軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.4.5 Western blot檢測Akt、eNOS蛋白磷酸化水平以及caspase-3，Bax/Bcl-2表達(dá)水平：缺血/再灌注60 min后立即取6組大鼠心肌組織，充分剪碎、研磨，3 ml/g蛋白裂解液充分裂解后，以10 000 g離心40 min。BCA法測定總蛋白濃度后分別將6組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，再分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗p-eNOS(1∶2 500)、eNOS(1∶4 000)、Akt(1∶5 000)、p-Akt(1 2 500)、caspase-3(1∶4 000)，Bax(1∶1 500)、Bcl-2(1∶2 000)孵育過夜，二抗孵育4 h，加入顯色劑顯色后，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件計算灰度值。

2 結(jié)果

2.1 動物存活情況 實驗過程中共有8只大鼠死亡，因突發(fā)惡性心律失常死亡5只，出血死亡2只，設(shè)備故障死亡1只，余大鼠均存活并計入統(tǒng)計學(xué)分析。

2.2 6組大鼠血清及心肌組織NO、TAOC表達(dá)比較 模型組大鼠血清及心肌組織NO、TAOC顯著低于對照組(P<0.01)，BAR組在血清及心肌組織NO、TAOC表達(dá)水平顯著高于模型組(P<0.05)。見表1。

組別NO(μmol/L)血清心肌組織TAOC(mmol/g prot)血清心肌組織對照組(n=12)21.85±2.965.87±0.890.79±0.130.34±0.05模型組(n=9)8.31±1.75*1.72±0.63*0.27±0.33*0.16±0.08*陽性對照組(n=11)16.28±1.74△4.58±0.64#0.31±0.110.18±0.04BAR低濃度預(yù)處理組(n=10)9.03±1.082.84±0.31#0.32±0.140.16±0.11BAR中濃度預(yù)處理組(n=11)14.11±1.25△3.16±0.42#0.46±0.09#0.17±0.09BAR高濃度預(yù)處理組(n=11)15.91±1.62△5.07±0.67△0.63±0.12#0.23±0.07#

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01

2.3 6組大鼠血清及心肌組織MDA、SOD、CAT、GSH-px含量 模型組大鼠血清及心肌組織MDA含量均顯著高于對照組(P<0.01)，但模型組血清及心肌組織SOD、CAT和GSH-px含量均顯著低于對照組(P<0.01)；BAR低、中、高處理組中血清及心肌組織MDA含量顯著下降，明顯低于模型組(P<0.05)，BAR組中血清及心肌組織SOD、CAT、GSH-px含量均顯著提高，均明顯高于模型組(P<0.05)。見表2。

組別MDA(nmol/mg prot)血清心肌組織SOD(U/mg prot)血清心肌組織CAT(U/mg prot)血清心肌組織GSH-px(U/mg prot)血清心肌組織對照組(n=12)15.74±1.244.38±0.5923.83±3.798.06±1.23183.24±12.6813.76±1.4646.92±5.0724.78±2.46模型組(n=9)52.86±2.92*17.41±1.08*4.16±1.28*0.83±0.46*39.75±10.45*1.07±0.49*8.19±1.12*2.47±0.85*陽性對照組(n=11)22.55±2.75△8.39±1.05#12.95±1.17#8.49±1.29△88.36±8.46#7.19±0.96△25.71±2.62#8.88±1.75#BAR低濃度預(yù)處理組 (n=10)42.96±3.78#15.93±1.325.94±2.112.82±0.64#49.27±9.75#3.94±1.08#16.11±1.02#9.14±1.18#BAR中濃度預(yù)處理組 (n=11)36.23±4.06#10.45±1.18#11.09±3.14#8.43±1.06△68.29±11.35#6.18±0.94#27.52±2.13#12.76±1.59#BAR高濃度預(yù)處理組 (n=11)30.28±2.56△6.88±2.07#16.75±1.54#13.22±2.09△99.41±10.58△8.77±0.92#33.09±3.16△19.14±1.67△

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01

2.4 6組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較 模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.01)，BAR低、中、高預(yù)處理組顯著低于模型組，并呈劑量依賴趨勢(P<0.05)。見表3,圖1。

2.5 6組大鼠Akt、eNOS蛋白磷酸化水平比較 結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織Akt、eNOS蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.01)，與模型組比較，BAR低、中、高處理組組心肌組織Akt、eNOS蛋白磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

組別凋亡率對照組(n=12)3.76±1.49模型組(n=9)19.61±1.75*陽性對照組(n=11)7.29±1.06△BAR低濃度預(yù)處理組(n=10)16.26±1.43#BAR中濃度預(yù)處理組(n=11)10.14±1.06#BAR高濃度預(yù)處理組(n=11)9.03±0.95△

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01

2.6 6組大鼠caspase-3、Bax/Bcl-2表達(dá)水平 結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著提高(P<0.01)，而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，BAR組大鼠心肌組織caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，并呈劑量依賴趨勢(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，也呈劑量依賴趨勢(P<0.05)。見表5。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測的各組心肌細(xì)胞凋亡率；A 對照組；B 模型組；C 陽性對照組；D BAR低濃度處理組；E BAR中濃度處理組；F BAR高濃度處理組

組別Akt蛋白eNOS蛋白對照組(n=12)100.0±5.42100.0±5.62模型組(n=9)35.23±2.02*58.32±2.35*陽性對照組(n=11)91.46±4.21△95.63±5.05△BAR低濃度預(yù)處理組(n=10)44.60±1.86#70.80±2.52#BAR中濃度預(yù)處理組(n=11)58.49±2.61△73.75±2.10#BAR高濃度預(yù)處理組(n=11)71.68±3.92△92.03±4.61△

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01

組別caspase-3蛋白Bax蛋白Bcl-2蛋白對照組(n=12)1.15±0.220.68±0.1615.01±1.28模型組(n=9)17.10±1.35*22.65±0.95*1.31±0.25*陽性對照組(n=11)4.38±0.65△6.52±0.3111.73±1.01△BAR低濃度預(yù)處理組(n=10)14.76±1.23#17.66±0.52#5.22±0.36#BAR中濃度預(yù)處理組(n=11)13.82±1.10#15.28±0.61△10.05±0.54△BAR高濃度預(yù)處理組(n=11)9.89±0.82△8.24±0.33△11.12±0.65△

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01

2.7 6組大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)比較 對照組組大鼠心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞無水腫，間質(zhì)未見異常。模型組組大鼠心肌纖維斷裂、排列紊亂，間質(zhì)水腫，部分肌纖維壞死，明顯炎性細(xì)胞浸潤。陽性對照組大鼠心肌纖維斷裂、排列紊亂程度較輕，間質(zhì)未見明顯異常。BAR低、中、高濃度組大鼠心肌纖維斷裂、間質(zhì)水腫、排列紊亂程度逐步減輕，炎性細(xì)胞明顯減少。見圖2。

圖2 6組大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE染色×400)；A 對照組；B 模型組；C 陽性對照組；D BAR低濃度處理組；E BAR中濃度處理組；F BAR高濃度處理組

3 討論

MIRI是一種復(fù)合多種因素參與的復(fù)雜病理過程，再灌注后心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激損傷、炎性反應(yīng)以及心肌細(xì)胞凋亡是MIRI發(fā)生的主要機(jī)制。MIRI后，再灌注后的心肌細(xì)胞分泌大量的炎性因子，如白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞被激活，不斷向心肌細(xì)胞內(nèi)趨化，從而產(chǎn)生大量自由基[7]。此外，被激活的氧自由基進(jìn)一步誘導(dǎo)胞膜脂質(zhì)過氧化、心肌酶外漏以及膜結(jié)構(gòu)的破壞，從而增加心肌細(xì)胞膜的通透性，繼而導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載對心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷[8]。并且，氧自由基及鈣超載可導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mPTP)增加，并釋放細(xì)胞色素C(Cyt C)進(jìn)入胞漿，干擾細(xì)胞能量代謝，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[9,10]。本研究顯示，MIRI后血清和心肌組織NO及總抗氧化能力(TAOC)水平顯著降低，而BAR則能明顯提高血清和心肌組織NO及TAOC水平。MDA是脂質(zhì)氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低反映體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生和釋放水平[11]。SOD是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶，也是細(xì)胞內(nèi)主要的自由基清除劑，其水平的高低，可反映出內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)功能[12]。CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。GSH-px可催化過氧化氫分解，其表達(dá)水平的高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力[13]。研究顯示，MIRI后心肌組織MDA含量增高，而CAT、SOD及GSH-px等抗氧化酶類消耗增加，使活性氧的生成和清除的平衡被打破，從而激發(fā)心肌細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷[14]。本研究顯示，MIRI后血清和心肌組織MDA含量明顯提高，而CAT、SOD及GSH-px含量顯著降低，BAR則能明顯降低MDA含量，提高CAT、SOD及GSH-px含量，從而降低氧化應(yīng)激水平。

心肌細(xì)胞凋亡在MIRI進(jìn)程中最為嚴(yán)重的階段，Bcl-2一種重要的抗凋亡蛋白，具有保護(hù)細(xì)胞生存并且不促進(jìn)細(xì)胞增殖的特性，能通過線粒體膜抑制caspase-3和Cyt C的釋放[15]。Bax是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)最主要的凋亡蛋白之一，其主要通過抑制Bcl-2活性而發(fā)揮促凋亡效應(yīng)[16]，Bax可通過激活caspase-3，以及促進(jìn)Cyt C釋放，干擾心肌細(xì)胞能量代謝，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為，Bcl-2的表達(dá)可抑制多種因素引起的細(xì)胞凋亡，而Bax則主要通過抑制Bcl-2的活性發(fā)揮促凋亡效應(yīng)。但二者表達(dá)處于相互拮抗的動態(tài)平衡，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[17]。本研究顯示，MIRI后模型組大鼠心肌組織caspase-3及Bax蛋白大量表達(dá)，Bcl-2蛋白顯著降低，BAR則可顯著抑制caspase-3及Bax，提高Bcl-2表達(dá)，從而降低MIRI后大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

為了從分子水平探討B(tài)AR對MIRI后心肌細(xì)胞凋亡的影響，本實驗研究了BAR對MIRI后心肌Akt/eNOS信號通路的影響。研究顯示，PI3K/Akt信號通路對MIRI的主要保護(hù)性信號通路之一。Akt是位于PI3K下游主要效應(yīng)分子，Akt的磷酸化能對MIRI后心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[18,19]。NO可通過防止心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載、抑制mPTP開放而發(fā)揮抗凋亡作用，活化的Akt可激活eNOS，誘導(dǎo)NO通路對MIRI后心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用[20]。本研究顯示，模型組大鼠心肌組織Akt及其eNOS磷酸化水平較對照組顯著下降，提示MIRI后大鼠心肌組織Akt/eNOS信號通路受到明顯抑制，NO含量也隨之減少，而BAR預(yù)處理組中Akt及eNOS磷酸化水平顯著提高，NO含量也叫模型組明顯提高，提示BAR可能通過激活A(yù)kt/eNOS信號通路、增加NO合成而發(fā)揮MIRI后心肌保護(hù)作用。

綜上，BAR可有效改善MIRI大鼠心肌損傷，其機(jī)制可能是通過激活A(yù)kt/eNOS信號通路，提高抗氧化能力，抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。