韓靜綺 張易青 冶俊玲 郭新建 王豐梅 (青海大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，青海 西寧 810001)

CXC趨化因子配體(CXCL)4L1為血小板衍生的趨化因子CXCL4的同源物質(zhì)〔1〕，CXCL4L1和CXCL4有34%的氨基酸序列不同，這種不同主要存在于編碼信號分子序列的C末端氨基酸序列。并且，當(dāng)肽鏈進(jìn)一步折疊成成熟的蛋白質(zhì)后發(fā)現(xiàn)，兩種物質(zhì)結(jié)構(gòu)比對僅有4.3%的不同。相對于CXCL4來說，CXCL4L1具有更大的潛力抑制細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔2,3〕。通過移植肺癌細(xì)胞A549、小鼠肺癌細(xì)胞LLC和小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的裸鼠喂食重組CXCL4L1后，裸鼠的成瘤性降低〔4〕。雖然CXCL4L1和CXCL4的分泌與作用機(jī)制不同，但是這兩種細(xì)胞因子具有相似的功能。與CXCL4相比，CXCL4L1具有更低的多糖結(jié)合親和性，而且不論在體內(nèi)還是體外研究中，CXCL4L1具有更好的擴(kuò)散性。這些不同主要是由于單個氨基酸的不同所引起的〔5〕。CXCL4L1不僅在血小板巨核細(xì)胞家族中有表達(dá)，在免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞中也可以表達(dá)，例如平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞。同時趨化因子受體CXCR3也在多種細(xì)胞中表達(dá)，包括免疫細(xì)胞，血管細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞〔6,7〕。CXCR3具有多種異構(gòu)體，包括CXCR3-A、CXCR3-B和CXCR3-alt。其中CXCR3-A主要在Th1-CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中表達(dá)，并且表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤發(fā)展的功能。CXCR3-B與CXCR3-A相比，具有一個氨基酸末端的延伸，主要具有抑制血管生成的作用〔8〕。有報(bào)道表明CXCL4L1通過和CXCR3-B相結(jié)合可以抑制角膜新生血管的發(fā)展，當(dāng)用抗CXCR3-B的單克隆抗體作用于小鼠時，可以有效解除CXCL4L1對于角膜新生血管發(fā)展的抑制作用〔9,10〕。有研究已經(jīng)報(bào)道關(guān)于外源性的CXCL4L1或者CXCL4L1的C末端片段在皮下腫瘤模型中的作用，但是有關(guān)它在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用未做進(jìn)一步分析。本文研究CXCL4L1和CXCR3的表達(dá)及二者在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 Hoechst33342，RNA提取試劑盒(美國，Thermo Scientific)，DMEM培養(yǎng)液，血清(美國，gibco)，兔抗人CXCL4L1抗體(ab97799)，鼠抗人CXCR3抗體(ab64714)，兔抗人GFP標(biāo)記CXCR3抗體(ab71864)，兔抗人藻紅蛋白(PE)標(biāo)記CXCL4L1抗體(ab83123)(美國，Abcam)，transwell小室(中國，碧云天)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3，胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞Panc-1和成肌纖維細(xì)胞(MF)C2C12購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)和雙抗的DMEM和MEM培養(yǎng)基中，放入5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3共培養(yǎng) 2×105胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3接種于transwell小室的上層，3×105個MF接種于transwell小室的下層于6孔板中，添加20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)。

1.4臨床樣本 胰腺癌早期患者20例，其中胰腺腺癌肺轉(zhuǎn)移患者10例，胰腺導(dǎo)管癌肺轉(zhuǎn)移患者10例(術(shù)前未經(jīng)任何治療)。其中男8例，女12例，年齡60～85歲，平均年齡(68.32±5.31)歲。組織樣本(術(shù)后取下經(jīng)液氮凍存)均經(jīng)過病理證實(shí)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1RT-PCR 從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲取目的基因CXCL4(Hs0090185_m1)和CXCL4L1(Hs99906_m1)的mRNA序列，引物由上海生工設(shè)計(jì)并合成。取對數(shù)期長勢良好胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3和胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞Panc-1，消化計(jì)數(shù)后，以105個細(xì)胞每孔的數(shù)目接種于六孔板內(nèi)，貼壁培養(yǎng)24 h。按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA，并檢測RNA含量。將所得RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(42℃ 30 min，85℃ 5 min)。對樣品進(jìn)行梯度稀釋，得到6個濃度的模板，冰上加樣SYBR Premix EX TapⅡ(10 μl)，底漆混合物(1.6 μl)，cDNA(1.5 μl)，dH2O(6.9 μl)。離心，在Rt-PCR儀(Thermo，7900HT)上進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算擴(kuò)增效率。

1.5.2免疫熒光 BxPC3和經(jīng)MF共培養(yǎng)的BxPC3細(xì)胞，胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3和胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞Panc-1培養(yǎng)于24孔板中，待細(xì)胞長到80%左右開始進(jìn)行熒光染色。用醋酸-乙醇固定液固定細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)搖床上漂洗5 min，分別加入Hoechst 33342工作液，GFP-CXCR3抗體(1∶500)，PE-CXCL4L1抗體(1∶800)進(jìn)行染色，室溫15 min，PBS漂洗3次，每次5 min，加入甘油與PBS(1∶9)的混合液，熒光顯微鏡(日本，Nikon，Ti-s)下觀察，熒光顯微鏡下拍片，采用ImagePlus 7.0 軟件對各組細(xì)胞中的熒光表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.5.3免疫組化 制備胰腺癌早期患者組織樣本切片，在載玻片上將切片固定好之后進(jìn)行干燥處理。在二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)中進(jìn)行脫蠟，后置于100%的純酒精(Ⅰ)(Ⅱ)和梯度為95%、80%、70%的酒精和水中各5 min進(jìn)行水化。水化完成后的片子置于3%的H2O2中，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次。將片子置于檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH6.0)中加熱，待沸騰后改中火(92℃以上)，室溫下復(fù)溫，PBS洗滌3次。吸干多余液體，滴加山羊血清封閉液，在37℃的溫度下孵育30 min。滴加異硫氰酸熒光素(FITC)-CXCR3抗體(1∶600)和PE-CXCL4L1抗體(1∶800)，在4℃的溫度下過夜，取出后置于37℃烤箱中復(fù)溫30 min，用磷酸鹽吐溫緩沖溶液(PBST)洗3次。滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，在37℃的溫度下孵育1 min，PBST洗滌3次。用3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒進(jìn)行顯色30 min，顯色終止后清洗切片。滴加蘇木素室溫染液3 min，清水沖洗，鹽酸酒精分化1 s，氨水返藍(lán)5 min。將片子分別放入70%、80%的酒精各1 min，90%的酒精2 min，95%的酒精3 min，100%的酒精(Ⅰ)(Ⅱ)各3 min。二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)中各放置15 min，晾干，中性樹膠封片。每個標(biāo)本的陰性對照只滴加PBS液，在顯微鏡(CK30-F200，日本Olympus公司)下觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0行成組t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR檢測CXCL4和CXCL4L1胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3和胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞Panc-1中的表達(dá) CXCL4在胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3和胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞Panc-1中均有表達(dá)，其mRNA相對表達(dá)量分別為1.75±0.21、1.59±0.19，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.384，P=0.196)；CXCL4L1在胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞Panc-1中 mRNA相對表達(dá)量為(2.05±0.23)，而在胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3中幾乎不表達(dá)，mRNA相對表達(dá)量僅為(0.03±0.01)，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.237，P=0.032)。

2.2免疫熒光檢測CXCL4L1在BxPC3和經(jīng)MF共培養(yǎng)的BxPC3細(xì)胞中的表達(dá) 圖1結(jié)果表明，CXCL4L1在胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3中不表達(dá)，但在MF共培養(yǎng)的BxPC3細(xì)胞中高表達(dá)。BxPC3與培養(yǎng)的MF中CXCL4L1的相對熒光表達(dá)量為(27.80±0.43)%，與單獨(dú)BxPC3細(xì)胞培養(yǎng)的相對熒光表達(dá)量(1.07±0.02)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.223，P=0.004)。

圖1 CXCL4L1在BxPC3和經(jīng)MF共培養(yǎng)的BxPC3細(xì)胞中的表達(dá)(×200)

2.3免疫熒光檢測CXCR3在胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3和胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞Panc-1中的表達(dá) 圖2結(jié)果表明，CXCR3在胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3中幾乎不表達(dá)，相對熒光表達(dá)量為(1.03±0.02)%，在胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞Panc-1中高表達(dá)，相對熒光表達(dá)量為(15.73±0.52)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.005，P=0.000)。

圖2 CXCR3在胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3和胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞Panc-1中的表達(dá)(×400)

2.4免疫組化檢測CXCL4L1在胰腺癌組織和肺轉(zhuǎn)移的組織中的表達(dá) 胰腺腺癌原發(fā)腫瘤組織中CXCL4L1的陽性表達(dá)與肺轉(zhuǎn)移比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.333，P=0.068)；相比于胰腺導(dǎo)管癌原發(fā)腫瘤組織，CXCL4L1在肺轉(zhuǎn)移胰腺導(dǎo)管癌組織中高表達(dá)(χ2=5.051，P=0.025)，見圖3和表1。

圖3 免疫組化檢測CXCL4L1在胰腺癌組織和肺轉(zhuǎn)移的組織中的表達(dá)(×400)

2.5免疫組化檢測CXCR3在胰腺癌組織和肺轉(zhuǎn)移的組織中的表達(dá) 在胰腺腺癌原發(fā)腫瘤組織中CXCR3不表達(dá)，而在肺轉(zhuǎn)移組織中CXCR3高表達(dá)(χ2=8.571，P=0.003)。在胰腺導(dǎo)管癌原發(fā)腫瘤組織中CXCR3低表達(dá)，而在肺轉(zhuǎn)移組織中CXCR3高表達(dá)(χ2=9.899，P=0.002)。見表2、圖4。

表1 CXCL4L1在胰腺癌組織中的表達(dá)情況(n,n=10)

表2 CXCR3在胰腺癌組織中的表達(dá)情況(n,n=10)

圖4 免疫組化檢測CXCR3在胰腺癌組織和肺轉(zhuǎn)移的組織中的表達(dá)(×200)

3 討 論

胰腺癌是全球第五大癌癥，其治愈率低，死亡率高〔11,12〕。根據(jù)胰腺癌的病理類型，胰腺癌可分為導(dǎo)管腺癌(導(dǎo)管腺癌占胰腺癌的80%～90%)，腺鱗癌，腺泡細(xì)胞癌(僅占1%)，小腺體癌(為少見類型的胰腺癌)，小細(xì)胞癌(占胰腺癌的1%～3%)〔13,14〕。因此本文主要研究了常見的胰腺導(dǎo)管癌和胰腺腺癌。在胰腺癌細(xì)胞中，CXCL4L1和CXCL4的表達(dá)水平并不是完全一致的。例如，體外的胰腺癌細(xì)胞或者在腫瘤移植后的細(xì)胞BxPC3和Panc-1中，CXCL4L1的表達(dá)水平增加，而CXCL4的表達(dá)水平并沒有增加。CXCL4也許在人胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞系PDAC的病理學(xué)過程中可能起到重要作用，但其具體的機(jī)制還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。研究表明，CXCL4L1在結(jié)腸癌和食管癌中均有表達(dá)〔15,16〕。而在子宮內(nèi)膜移位結(jié)合的卵巢癌中CXCL4L1和 CXCL4的表達(dá)水平看起來低于其在正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜移位的組織中的表達(dá)，但是這僅僅發(fā)生于腫瘤結(jié)合的巨噬細(xì)胞中〔17〕。CXCL4L1抗體可以將腫瘤轉(zhuǎn)移灶作為靶點(diǎn)，但在人體中，如果將CXCL4L1作為靶點(diǎn)，可能同時會影響正常細(xì)胞的功能，所以CXCL4L1作為腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)還存在著爭議。由于CXCL4L1的擴(kuò)散能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于CXCL4，所以CXCL4L1并不會僅僅存在于腫瘤組織中〔18,19〕。因此，需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明CXCL4L1作為腫瘤靶點(diǎn)的合理性。本研究結(jié)果表明，CXCL4L1在胰腺腺癌細(xì)胞BxPC3中不表達(dá)，但在經(jīng)MF共培養(yǎng)的BxPC3細(xì)胞中CXCL4L1卻高表達(dá)。MF可以模擬體內(nèi)微環(huán)境，說明當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于一個穩(wěn)定的微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞可以上調(diào)CXCL4L1的表達(dá)。CXCR3 作為CXCL4L1的受體，二者結(jié)合后可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移和存活。本研究結(jié)果說明CXCR3在胰腺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。CXCL4L1作為胰腺癌發(fā)展的一個新穎的調(diào)節(jié)因子，不僅在腫瘤的微環(huán)境中發(fā)揮作用，同時還在轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中高表達(dá)〔20〕?？赡鼙磉_(dá)有CXCL4L1的腫瘤細(xì)胞受到基質(zhì)腫瘤細(xì)胞的接觸控制，同時受到表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)有關(guān)。為了進(jìn)一步了解特異的腫瘤微環(huán)境和表觀遺傳學(xué)基質(zhì)對于腫瘤細(xì)胞表達(dá)CXCL4L1以及CXCL4L1在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)作用，本文通過實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)微環(huán)境，表明可以上調(diào)CXCL4L1的表達(dá)，CXCR3在胰腺導(dǎo)管癌原癌組織中低表達(dá)，而在肺轉(zhuǎn)移組織中高表達(dá)，為胰腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。