蔡小霞，苑靜，林童，郭徐靜，熊勇華，吳科盛，郭亮*

1(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047) 2(南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌，330047) 3(江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西 南昌，330029)

赭曲霉毒素是一類由曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要包括赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)，赭曲霉毒素B(ochratoxin B，OTB)和赭曲霉毒素C(ochratoxin C，OTC)。其中OTA毒性最大，對(duì)人和動(dòng)物具有致畸性、致癌性及免疫毒性等多種毒性作用，已被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究署定為2B類致癌物[1]。OTA因其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定而廣泛存在于谷糧類食品和飼料等農(nóng)產(chǎn)品中，對(duì)人畜健康和世界經(jīng)濟(jì)造成的危害僅次于黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)[2]。目前食品中OTA的定性、定量檢測(cè)方法主要包括色譜法、酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和免疫層析試紙條法(immunochromatographic test strip，ICA)等。其中，高效液相色譜法是當(dāng)前常用的確證定量檢測(cè)方法，但是該方法需要昂貴的大型儀器設(shè)備、繁復(fù)費(fèi)時(shí)的樣品前處理過(guò)程以及相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員，檢測(cè)成本高且耗時(shí)費(fèi)力[3]。ELISA和ICA均為基于抗原、抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)檢測(cè)方法，具有特異性好、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、耗時(shí)少等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于食品中有害物質(zhì)的快速篩查及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。但是免疫學(xué)檢測(cè)中使用的抗體穩(wěn)定性差、制備過(guò)程復(fù)雜、批間差異大且成本高，檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性難以控制，檢測(cè)條件及檢測(cè)產(chǎn)品保存條件要求較高[4]。

核酸適配體是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選獲得的，能與相應(yīng)配體進(jìn)行高親和力特異性結(jié)合的寡核苷酸序列(DNA或RNA)。它與配體間的親和力可與抗原抗體間相互作用相媲美，同時(shí)具有抗理化因素干擾能力強(qiáng)、可體外人工合成、制備成本低且無(wú)批間差異及易運(yùn)輸保存等諸多優(yōu)點(diǎn)。因此，以適配體替代抗體作為識(shí)別元件的生物傳感器已逐漸成為分析檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。CRUZ-AGUADO等[5]于2008年首次篩選出具有高親和力和高特異性的OTA核酸適配體并已被廣泛應(yīng)用，但迄今OTB和OTC適配體尚未見(jiàn)報(bào)道。適配體傳感器常用的檢測(cè)模式與免疫學(xué)檢測(cè)方法類似，包括競(jìng)爭(zhēng)型和夾心型2類。其中，對(duì)真菌毒素等小分子化合物的檢測(cè)多采用目標(biāo)物和互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體的模式進(jìn)行。雖然適配體傳感器已被廣泛用于真菌毒素等各類目標(biāo)物的分析，但是由于樣品基質(zhì)可干擾檢測(cè)信號(hào)及目標(biāo)物的識(shí)別，因此其仍難以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品中痕量目標(biāo)物的快速超靈敏檢測(cè)。

表面功能化磁性微納米材料，尤其是磁性亞微米或納米材料，因其比表面積大、磁操作簡(jiǎn)便、溶液中懸浮性良好，可有效提高磁珠表面的反應(yīng)或吸附效率，并實(shí)現(xiàn)待測(cè)物或檢測(cè)探針與樣品基質(zhì)的快速分離及富集濃縮[6]。因此，磁性微納米材料在復(fù)雜樣品前處理[7]、傳感器構(gòu)建[8]和即時(shí)檢測(cè)新方法建立[9]等分析測(cè)試領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。其中，基于磁性材料以核酸適配體為識(shí)別元件的磁性適配體傳感器，具有識(shí)別反應(yīng)效率高的特點(diǎn)，可通過(guò)快速分離富集待測(cè)物或信號(hào)探針提高復(fù)雜基質(zhì)檢測(cè)時(shí)的信噪比，進(jìn)而提高適配體傳感器的檢測(cè)靈敏度，以及簡(jiǎn)化操作并縮短檢測(cè)時(shí)間等?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，近年來(lái)適配體傳感器、基于磁性材料的傳感器以及磁性適配體傳感器的相關(guān)研究數(shù)量均迅速增加(圖1)。其中，磁性適配體傳感器相關(guān)研究的增長(zhǎng)最為顯著，近十年來(lái)開(kāi)始逐步受到關(guān)注。

圖1 由Web of Science提供歷年來(lái)磁性傳感器、適配體傳感器、磁性適配體傳感器的相關(guān)論文發(fā)表情況Fig.1 Publishment on magnetic sensor, aptasensor andmagnetic aptasensor over the years from Web of Science

由于適配體與靶標(biāo)識(shí)別后不能產(chǎn)生可檢測(cè)的特殊信號(hào)，故需將其識(shí)別過(guò)程通過(guò)標(biāo)記探針或化學(xué)反應(yīng),轉(zhuǎn)換成易識(shí)別的物理或化學(xué)信號(hào)。根據(jù)輸出信號(hào)的不同，可將適配體傳感器分為光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器、核酸定量型傳感器等。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料已被廣泛應(yīng)用于改進(jìn)或替代上述各類傳感器的傳統(tǒng)信號(hào)生成模式，以提高其檢測(cè)靈敏度及穩(wěn)定性。此外，基于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的生物技術(shù)亦被越來(lái)越多地應(yīng)用于適配體傳感器的信號(hào)放大。本文綜述了2011年以來(lái)基于磁性材料的適配體傳感器在赭曲霉毒素超靈敏檢測(cè)中的應(yīng)用，其中著重對(duì)近5年來(lái)此類傳感器在設(shè)計(jì)思路、適配體檢測(cè)探針的制備方法以及應(yīng)用納米材料和生物技術(shù)提高其檢測(cè)靈敏度等方面的最新進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)分析，以期為相關(guān)科研工作者在真菌毒素的超靈敏檢測(cè)提供一定的理論及應(yīng)用參考依據(jù)。

1 光學(xué)磁性適配體傳感器

光學(xué)適配體傳感器是指將適配體和目標(biāo)分子之間的特異性相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓽y(cè)定的光學(xué)信號(hào)的裝置，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)[10]。各類光學(xué)磁性適配體傳感器在OTA檢測(cè)方面的應(yīng)用及其機(jī)理如下所述。

1.1 比色法適配體傳感器

比色法是光學(xué)傳感器中最為常見(jiàn)且簡(jiǎn)便的一種檢測(cè)模式，主要借助顏色反應(yīng)對(duì)溶液中的化合物進(jìn)行檢測(cè)。該方法不需要昂貴復(fù)雜的儀器，且可實(shí)現(xiàn)裸眼檢測(cè)。由于酶可提高顯色反應(yīng)速率、放大顯色信號(hào)，因此酶促顯色反應(yīng)在比色傳感器中最為常用。LIN等[11]以適配體為識(shí)別元件，并利用適配體連接表面修飾cDNA片段的磁珠和裝載大量辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的脂質(zhì)體制備三元復(fù)合物作為磁性檢測(cè)探針。檢測(cè)時(shí)，OTA可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體、破壞檢測(cè)探針，從而產(chǎn)生游離脂質(zhì)體。磁分離去除未反應(yīng)的檢測(cè)探針后，通過(guò)裂解磁吸上清中的脂質(zhì)體釋放HRP，即可催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)反應(yīng)顯色進(jìn)行檢測(cè)。與傳統(tǒng)ELISA相比，該方法的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)在懸浮于溶液中的磁珠表面進(jìn)行，而非孔表面，反應(yīng)面積大大增加，通過(guò)磁分離可快速簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)產(chǎn)物和檢測(cè)探針的分離，避免了包板、洗板等繁復(fù)的操作步驟。因此，磁珠的應(yīng)用有效地提高了反應(yīng)效率，同時(shí)簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程。此外，因單個(gè)脂質(zhì)體中包裹了大量HRP，該傳感器檢測(cè)靈敏度較高，其檢出限(limit of detection，LOD)可達(dá)0.023 ng/mL。

由于天然酶的穩(wěn)定性較差、價(jià)格昂貴，近年來(lái)具有模擬酶活性的各種納米材料因催化活性高、穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉且可大量制備等優(yōu)點(diǎn)，在傳感、環(huán)境處理及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)步顯著[12]。WANG等[13]設(shè)計(jì)了一種基于表面修飾cDNA的金磁納米粒子的OTA比色傳感器。該金磁納米粒子由金納米粒子(Au nanoparticles，AuNPs)和Fe3O4納米粒子摻雜而成，同時(shí)具備類過(guò)氧化物酶活性和氧化鐵的磁學(xué)特性。當(dāng)反應(yīng)體系中存在OTA時(shí)，金磁納米粒子可從固相支持物上被競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)，同時(shí)通過(guò)磁吸實(shí)現(xiàn)催化劑的富集與分離。在該傳感器中，信號(hào)探針自身具有磁性，因此可簡(jiǎn)便地通過(guò)磁富集提升信號(hào)強(qiáng)度，從而增高檢測(cè)靈敏度。TIAN等[14]則將堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和具備類過(guò)氧化物酶活性的MnO2納米片聯(lián)用構(gòu)建了一種“turn off”型OTA比色傳感器。當(dāng)OTA存在時(shí)，通過(guò)適配體和cDNA雜交雙鏈結(jié)合于納米磁珠表面的ALP被競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)，并催化抗壞血酸磷酸鹽產(chǎn)生抗壞血酸(ascorbic acid，AA)。由于AA具有還原性，可將Mn4+轉(zhuǎn)化為Mn2+，破壞MnO2納米片的結(jié)構(gòu)和模擬酶活性，從而使TMB顯色降低。

此外，變色染料(如酸堿指示劑)也可用于輸出比色信號(hào)。和常見(jiàn)酶促反應(yīng)顯色相比，這類試劑具有顯色步驟簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉等特點(diǎn)。HAO等[15]構(gòu)建了一種基于(磁性)石墨烯、適配體和4種變色染料的比色傳感器，用于4種毒素的同時(shí)檢測(cè)。該傳感器中的磁性石墨烯通過(guò)4種適配體，分別與荷載不同變色染料的石墨烯結(jié)合。當(dāng)某種待測(cè)物存在時(shí)，其相應(yīng)適配體連接的荷載染料的石墨烯與磁性石墨烯分離。由于4種變色染料的釋放及顯色條件不同，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系經(jīng)磁分離后，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH值，可依次釋放不同染料并呈現(xiàn)不同的顏色。其中，對(duì)OTA的檢測(cè)范圍及LOD分別為5～250 ng/mL和5 ng/mL。

1.2 化學(xué)發(fā)光適配體傳感器

化學(xué)發(fā)光(chemiluminiscence，CL)是物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中伴隨的一種電磁輻射現(xiàn)象?；瘜W(xué)發(fā)光分析法靈敏度高、檢測(cè)限寬、儀器相對(duì)簡(jiǎn)單、操作較簡(jiǎn)便且可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，目前在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在眾多化學(xué)發(fā)光體系中，過(guò)氧化物酶催化H2O2氧化魯米諾發(fā)光最為常見(jiàn)。因此，具備類過(guò)氧化物酶活性的AuNPs也被作為催化劑應(yīng)用于基于魯米諾發(fā)光反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系中。例如李素等[16]將多條生物素標(biāo)記的cDNA片段2，通過(guò)適配體連接至修飾有cDNA片段1的磁珠表面，作為檢測(cè)探針。競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)后，利用磁回收的檢測(cè)探針上殘留的生物素標(biāo)記的cDNA片段2，捕獲鏈霉親和素標(biāo)記的AuNPs，并加入羥胺/Au3+使檢測(cè)探針上的AuNPs繼續(xù)生長(zhǎng)以增強(qiáng)其化學(xué)發(fā)光能力，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度，該方法LOD低至1.58 pg/mL。

由于適配體傳感器中的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)產(chǎn)物是DNA分子，核酸反應(yīng)可用于競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)信號(hào)的放大以提高檢測(cè)靈敏度。HUN等[17]構(gòu)建了一種利用DNA聚合酶和內(nèi)切酶進(jìn)行信號(hào)放大的OTA化學(xué)發(fā)光傳感器，該傳感器由2種核酸修飾的納米磁珠、cDNA和輔助DNA(與cDNA部分互補(bǔ)并含缺口內(nèi)切酶Nb. Bbvcl的識(shí)別位點(diǎn))組成。其中表面修飾適配體的磁珠可與cDNA雜交形成探針復(fù)合物。當(dāng)OTA存在時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)產(chǎn)生的游離cDNA磁吸后殘留在上清中，并與輔助DNA部分序列雜交形成復(fù)合物。以cDNA為引物，Phi29 DNA聚合酶可催化聚合形成完整的輔助DNA互補(bǔ)鏈。該互補(bǔ)鏈可被Nb. Bbvcl切割成cDNA和一條短單鏈DNA(short single-stranded DNA，ssDNA)。其中，新生成的cDNA又可引發(fā)新的聚合及切割過(guò)程產(chǎn)生新的ssDNA。因此，經(jīng)多次“聚合-切割”循環(huán)后，一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)產(chǎn)物(cDNA)即可引發(fā)形成大量報(bào)告分子(ssDNA)，從而放大反應(yīng)信號(hào)。在化學(xué)發(fā)光階段，該ssDNA可作為連接臂，通過(guò)DNA序列互補(bǔ)配對(duì)作用，連接另一種核酸修飾的納米磁珠和異魯米諾標(biāo)記的SiO2納米粒子，形成三元雜交復(fù)合物。最后磁富集該復(fù)合物，并引入化學(xué)發(fā)光底物H2O2和催化劑Co2+反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。在該傳感器設(shè)計(jì)中，2種寡核苷酸修飾的納米磁珠分別起到了從反應(yīng)體系中分離未反應(yīng)的cDNA和捕獲濃縮ssDNA的作用，提高了傳感器設(shè)計(jì)的靈活性和檢測(cè)靈敏度。該適配體傳感器檢測(cè)OTA的線性范圍為1×10-3～50 ng/mL，LOD可達(dá)0.3 pg/mL。

1.3 熒光適配體傳感器

熒光是指熒光分子或熒光納米材料從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)發(fā)出的光?；跓晒庑盘?hào)的適配體傳感器具有較高的特異性、靈敏度，可分為標(biāo)記和無(wú)標(biāo)記2大類。近年來(lái)，基于磁性材料的OTA熒光適配體傳感器的相關(guān)研究見(jiàn)表1。

表1 基于磁性材料的熒光適配體傳感器在OTA檢測(cè)中的應(yīng)用概況Table 1 Applications of fluorescent aptasensors based onmagnetic material in ochratoxin A detection

注：**，表示文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道(下同)

多數(shù)熒光檢測(cè)采用標(biāo)記檢測(cè)法，其常用標(biāo)記物包括有機(jī)熒光分子、熒光團(tuán)及熒光納米粒子等。熒光分子廉價(jià)易得，但熒光較弱，因此研究者將一些共軛熒光聚合物作為激發(fā)光能量傳遞體，引入以熒光分子為標(biāo)記物的光學(xué)傳感器中，以提高其靈敏度[18]。聚(9,9-雙(6′-N，N，N-三甲基銨)己基)-亞芴基亞苯基二溴化物(poly(9,9-bis(6′-N,N,Ntrimethylammonium)hexyl)-fluorenylene phenylene dibromide，PFP)是一種典型的陽(yáng)離子共軛熒光聚合物，具有特定的主鏈和大量重復(fù)的吸收單元，其可通過(guò)靜電相互作用，與帶負(fù)電的熒光分子標(biāo)記的DNA形成穩(wěn)定的聚電解質(zhì)復(fù)合物，并將激發(fā)光能量通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用傳遞給DNA上的熒光分子，使其熒光信號(hào)增強(qiáng)。LIU等[19]首次結(jié)合使用PFP、羧基熒光素(carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)標(biāo)記的cDNA以及適配體修飾的磁珠用于檢測(cè)OTA，其LOD為0.11 ng/mL，比未使用PFP時(shí)靈敏度提高6倍。為進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，HAYAT等[20]用含有大量FAM分子的熒光微球標(biāo)記適配體，并以其為信號(hào)探針建立了基于表面偶聯(lián)抗原的磁珠的OTA間接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法。由于熒光微球熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于單個(gè)FAM分子，其LOD降至2 pg/mL。此外，WANG等[21]利用FAM的熒光信號(hào)可被轉(zhuǎn)化為消逝波信號(hào)的原理，開(kāi)發(fā)了一種基于適體的消逝波全纖維(evanescent wave all-fiber，EWA)生物傳感器用于OTA的檢測(cè)。該傳感器具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，可重復(fù)使用300次。

與有機(jī)熒光分子相比，熒光納米材料具有更高的熒光強(qiáng)度和良好的光穩(wěn)定性。其中，量子點(diǎn)(quantum dots，QDs)具有激發(fā)光譜廣、發(fā)射光譜窄、量子產(chǎn)率高等特點(diǎn)，常被作為熒光標(biāo)記物用于真菌毒素檢測(cè)[22]。而以含有大量QD的熒光微球?yàn)樘结?可進(jìn)一步增強(qiáng)探針熒光強(qiáng)度,進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度[23]。WANG等[24]成功設(shè)計(jì)了一種以內(nèi)部和表面帶有大量CdTe量子點(diǎn)的SiO2亞微米球?yàn)闊晒馓结?，表面修飾適配體的金磁粒子為捕獲探針的OTA適配體傳感器。其中金磁粒子表面的金殼層使磁性材料可簡(jiǎn)便、高效地與末端巰基化核酸鏈(適配體或cDNA)結(jié)合,并提高磁性材料的生物穩(wěn)定性。檢測(cè)時(shí)，OTA可將cDNA修飾的熒光探針從金磁粒子表面競(jìng)爭(zhēng)下來(lái),通過(guò)測(cè)定磁回收后,對(duì)上清中游離探針的熒光強(qiáng)度進(jìn)行OTA定量檢測(cè)，其LOD達(dá)5.4 pg/mL。QIAN等[25]則采用類似方法，以2種表面偶聯(lián)不同顏色QDs的硅球?yàn)樘结?，同時(shí)檢測(cè)小麥中的AFB1和OTA，其中OTA的LOD達(dá)0.67 pg/mL。在上述各檢測(cè)體系中，每發(fā)生一次競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)僅對(duì)應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)熒光探針的信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度仍然有限。因此，YAO等[26]借助滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling cycle amplification，RCA),建立了一種單次競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)對(duì)應(yīng)多個(gè)熒光探針信號(hào)的新型OTA檢測(cè)方法。該方法所用磁性檢測(cè)探針表面偶聯(lián)有含適配體的DNA片段，其序列與環(huán)狀模板部分互補(bǔ)。當(dāng)體系中無(wú)OTA時(shí)，含適配體的DNA片段可作為引物在環(huán)狀模板上反復(fù)滾環(huán)擴(kuò)增，形成含大量重復(fù)DNA片段的長(zhǎng)鏈核酸。該擴(kuò)增產(chǎn)物可與大量QDs標(biāo)記的cDNA信號(hào)探針雜交，使磁珠產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。而當(dāng)OTA存在時(shí)，檢測(cè)探針上的環(huán)狀模板脫落，使磁珠表面的RCA反應(yīng)因缺少模板無(wú)法進(jìn)行，磁珠熒光信號(hào)顯著降低。該方法通過(guò)磁吸可地除去多余的信號(hào)探針并濃縮磁珠，進(jìn)而提高信噪比和靈敏度，其LOD可達(dá)0.13 pg/mL。

上轉(zhuǎn)換納米粒子(upconversion nanoparticles，UCNPs)是一類含有鑭系離子的反-斯托克斯發(fā)光納米晶體，且其光學(xué)性質(zhì)可通過(guò)改變粒子中鑭系元素的組成和比例進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于激發(fā)發(fā)射模式與大多數(shù)熒光物質(zhì)相反，以UCNPs為檢測(cè)探針可克服基質(zhì)中熒光物質(zhì)的干擾，尤其適用于復(fù)雜生物樣品中的目標(biāo)物分析。DAI等[27]和WU等[28]先后利用適配體和cDNA相互作用制備UCNPs-磁性納米粒子復(fù)合物作為檢測(cè)探針,分別用于檢測(cè)啤酒和玉米中的OTA。當(dāng)OTA存在時(shí)，UCNPs從磁性復(fù)合物中競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)使其熒光減弱。因此，在磁回收去除游離UCNPs后,通過(guò)測(cè)定磁性復(fù)合物熒光強(qiáng)度變化,即可實(shí)現(xiàn)OTA定量檢測(cè)。研究結(jié)果表明，上述2種方法均有較寬的線性檢測(cè)范圍(0.01～100 ng/mL和0.000 1～1 ng/mL)。前者的實(shí)際樣品檢測(cè)限為5 pg/mL，后者的方法檢測(cè)限達(dá)0.1 pg/mL，且復(fù)合物探針在4 ℃保存30 d后檢測(cè)信號(hào)值僅損失1%。

與標(biāo)記分析方法相比，無(wú)標(biāo)記生物傳感器無(wú)需添加二級(jí)信號(hào)探針，更為簡(jiǎn)便、快捷，且檢測(cè)成本較低。ZHANG等[29]在磁珠表面偶聯(lián)適配體并與cDNA形成雙鏈，利用單鏈DNA可顯著增強(qiáng)Tb3+熒光強(qiáng)度的原理，依據(jù)OTA將單鏈cDNA競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)前后溶液熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行定量。該方法發(fā)光方式簡(jiǎn)單，無(wú)需熒光標(biāo)記過(guò)程，克服了標(biāo)記材料的高標(biāo)記成本和標(biāo)記效應(yīng)。此外，特定序列的DNA可結(jié)合金屬離子并反應(yīng)形成具有不同性能的金屬納米材料，如熒光金屬納米簇等。由于競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)產(chǎn)物是DNA，DNA金屬化是一種十分適于無(wú)標(biāo)記適配體傳感器的檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生方式[30]。如ZHANG等[31]利用Ag+可在還原劑的作用下，可以競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)產(chǎn)生的單鏈DNA為模板生長(zhǎng)熒光銀納米簇(Ag nanoclusters，AgNCs)的原理設(shè)計(jì)了一種無(wú)標(biāo)記OTA適配體傳感器。因金屬納米簇?zé)晒夥€(wěn)定性良好、量子產(chǎn)率高，其LOD可達(dá)2 pg/mL。其后，該課題組[32]利用Zn2+可增強(qiáng)銀納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的特性進(jìn)一步提高了上述適配體傳感器的檢測(cè)靈敏度。將其應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)OTA和AFB1，LOD分別為0.2和0.3 pg/mL。除銀納米簇外，DNA也可引發(fā)合成銅納米簇(Cu nanoclusters，CuNCs)作為熒光信號(hào)輸出單元。如HE等[33]在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)產(chǎn)生的游離cDNA末端,利用末端轉(zhuǎn)移酶形成延伸的Poly(T)長(zhǎng)鏈，并以其為模板引發(fā)生長(zhǎng)多個(gè)銅納米簇產(chǎn)生熒光信號(hào)。

1.4 表面增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)傳感器

目前利用表面增強(qiáng)拉曼散射(surface enhanced raman scattering，SERS)信號(hào)的磁性適配體OTA傳感器的檢測(cè)原理類似，均基于通過(guò)適配體和cDNA相互作用制備的磁珠-拉曼信號(hào)探針復(fù)合物[34-36]。當(dāng)OTA存在時(shí)，信號(hào)探針從磁性復(fù)合物上脫落，通過(guò)測(cè)定磁回收后磁性復(fù)合物或上清的拉曼信號(hào)變化進(jìn)行定量分析。由于拉曼散射很弱，拉曼分子應(yīng)用于檢測(cè)時(shí)需要通過(guò)化學(xué)修飾或置于強(qiáng)電磁場(chǎng)中進(jìn)行信號(hào)放大。貴金屬納米材料表面可形成高強(qiáng)局域電磁場(chǎng)(熱點(diǎn))，拉曼信號(hào)分子位于其中時(shí),拉曼散射強(qiáng)度可提高106倍，是一種良好的拉曼信號(hào)放大方式[37]。ZHAO等[34]通過(guò)在表面配位連接有拉曼分子的銀納米粒子表面還原生長(zhǎng)金殼層，制備得到拉曼分子位于銀核和金殼之間的核殼式拉曼探針(Ag@Au NPs)。由于拉曼信號(hào)同時(shí)被銀、金2種貴金屬放大，該探針具有很強(qiáng)的拉曼信號(hào)。將該探針應(yīng)用于磁性適配體傳感器同時(shí)檢測(cè)OTA和AFB1，OTA的LOD為6 pg/mL。SHAO等[35]則采用類似方法制備了具有納米間隙的金核金銀殼型核殼式拉曼探針(Au@Au-Ag NPs)，并將其與Fe3O4磁性納米材料聯(lián)合用于檢測(cè)OTA，其LOD為4 pg/mL。為進(jìn)一步提高拉曼信號(hào)強(qiáng)度，SONG等[36]以金磁納米粒子作為磁性材料與Au@Ag型核殼式拉曼探針結(jié)合使用。當(dāng)拉曼探針與金磁粒子形成復(fù)合物時(shí)，拉曼探針的信號(hào)可被金磁材料的金殼層進(jìn)一步增強(qiáng)。通過(guò)測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)后磁性復(fù)合物的拉曼信號(hào)變化檢測(cè)OTA，其LOD降至0.48 pg/mL。

2 電化學(xué)傳感器

電化學(xué)傳感器主要通過(guò)測(cè)量因電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)引發(fā)的電勢(shì)或電流信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。其具有操作簡(jiǎn)便、體積小、信噪比高和檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)基于磁性材料的OTA適配體電化學(xué)傳感器的相關(guān)研究見(jiàn)表2。

表2 基于磁性材料的電化學(xué)適配體傳感器在OTA檢測(cè)中的應(yīng)用概況Table 2 Applications of electrochemical aptasensors basedon magnetic material in ochratoxin A detection

2.1 基于酶標(biāo)抗原的適配體電化學(xué)傳感器

與傳統(tǒng)的以抗體為特異性識(shí)別元件的電化學(xué)傳感器原理類似，早期基于磁珠的OTA電化學(xué)適配體傳感器主要是利用酶標(biāo)抗原和抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁珠上的適配體，然后將磁珠磁吸至電極表面并依據(jù)酶促反應(yīng)引起的電流信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA的檢測(cè)。BARTHELMEBS等[38]和RHOUATI等[39]利用ALP酶標(biāo)記的OTA；BONEL等[40]利用HRP酶標(biāo)記的OTA與待測(cè)樣品中的OTA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁珠表面的適配體，繼而通過(guò)微分脈沖伏安法檢測(cè)電信號(hào)進(jìn)行OTA定量分析。上述傳感器中微納米磁珠的使用即可保證免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)和酶促反應(yīng)的高效進(jìn)行，又可在磁場(chǎng)作用下，方便快速地實(shí)現(xiàn)磁性納米粒子與未結(jié)合的酶標(biāo)抗原及樣品基質(zhì)快速分離，并定位富集至電極表面，且在檢測(cè)后可通過(guò)撤除磁場(chǎng)將磁珠從電極表面移除，從而縮短分析時(shí)間、提高檢測(cè)靈敏度并實(shí)現(xiàn)電極的表面快速更新和重復(fù)使用。

2.2 基于納米粒子的電化學(xué)傳感器

近年來(lái)納米粒子被作為標(biāo)記物廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器的構(gòu)建。例如量子點(diǎn)既可提供熒光信號(hào)也可產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)用于電化學(xué)檢測(cè)。WANG等[41]構(gòu)建了一種以cDNA修飾的石墨烯量子點(diǎn)微球和適配體修飾的金磁納米粒子復(fù)合物為檢測(cè)探針，并基于電化學(xué)發(fā)光和熒光雙重檢測(cè)信號(hào)的OTA適配體傳感器。當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)完成，磁分離后上清中游離的量子點(diǎn)微球可產(chǎn)生熒光信號(hào)，而磁回收的檢測(cè)探針經(jīng)重懸后可磁吸至電極表面，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。其中，熒光檢測(cè)模式較快，其LOD為3 pg/mL；電化學(xué)發(fā)光模式則更為靈敏，其LOD為0.5 pg/mL。

此外，以納米粒子為金屬離子供體，利用納米粒子消解產(chǎn)生的離子引發(fā)電信號(hào)，已被多種基于磁珠的OTA電化學(xué)適配體傳感器作為信號(hào)產(chǎn)生方式。因納米粒子可消解產(chǎn)生大量金屬離子，此類傳感器具有很高的檢測(cè)靈敏度。WANG等[42]用表面荷載CdTe或PbS量子點(diǎn)的硅球分別標(biāo)記OTA和伏馬菌素(fumonisin B1，F(xiàn)B1)適配體，然后將其與cDNA修飾的磁珠結(jié)合，制備2種毒素的檢測(cè)探針。當(dāng)OTA或FB1存在時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)釋放的硅球經(jīng)磁分離后殘留在上清中并被HNO3酸解產(chǎn)生Cd2+或Pb2+。然后利用鉍修飾的玻碳電極，以方波溶出伏安法(square-wave stripping voltammetry，SWSV)測(cè)定2種金屬離子產(chǎn)生的電信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA和FB1的同時(shí)檢測(cè)，其LOD分別為5和20 pg/mL。由于此類傳感器的靈敏度與檢測(cè)探針中納米粒子的含量相關(guān)，HAO等[43]利用表面荷載大量CdTe量子點(diǎn)的石墨烯/Au納米復(fù)合材料制備檢測(cè)探針，采用類似的模式和方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)OTA的超靈敏檢測(cè),其LOD為0.07 pg/mL。此外，RCA技術(shù)也可用于提高此類傳感器的檢測(cè)靈敏度。TONG等[44]設(shè)計(jì)的檢測(cè)探針由寡核苷酸鏈修飾的磁珠、適配體和輔助DNA片段組成。由于輔助DNA片段同時(shí)含有與磁珠表面寡核苷酸鏈以及適配體互補(bǔ)的DNA序列，三者可雜交形成復(fù)合物。當(dāng)OTA存在時(shí)，輔助DNA因適配體脫落形成的單鏈區(qū)可與磁珠表面寡核苷酸鏈的單鏈部分進(jìn)一步結(jié)合，形成環(huán)狀輔助DNA-磁珠復(fù)合物。在DNA聚合酶作用下，磁珠表面的寡核苷酸鏈可以環(huán)狀輔助DNA為RCA模板，擴(kuò)增形成含大量重復(fù)片段的長(zhǎng)鏈核酸。此時(shí)加入與重復(fù)片段互補(bǔ)配對(duì)的且標(biāo)記有CdS量子點(diǎn)的DNA探針，可使磁珠表面攜帶大量量子點(diǎn)，從而提高Cd2+電信號(hào)強(qiáng)度和檢測(cè)靈敏度。

2.3 基于電活性分子的適配體電化學(xué)傳感器

電活性分子，如亞甲基藍(lán)，是一類常用的DNA電化學(xué)傳感器雜交指示劑。與光學(xué)適配體傳感器一樣，基于核酸酶的核酸反應(yīng)也可用于DNA電化學(xué)傳感器的信號(hào)放大以提高檢測(cè)靈敏度。SHI等[45]構(gòu)建了一種基于雙鏈核酸外切酶III(exonuclease III，Exo III)的OTA適配體電化學(xué)傳感器,該傳感器檢測(cè)探針由納米磁珠通過(guò)其表面適配體和mDNA雜交而成。當(dāng)OTA存在時(shí)，mDNA被競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)并殘留在磁吸上清中。用表面修飾cDNA的金電極檢測(cè)磁吸上清時(shí)，與mDNA部分互補(bǔ)的cDNA與mDNA雜交形成雙鏈啟動(dòng)Exo III切割cDNA并釋放mDNA。游離mDNA又可與電極表面其他cDNA雜交,并繼續(xù)引發(fā)Exo III切割cDNA。經(jīng)多次循環(huán)后，磁吸上清中微量的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)產(chǎn)物mDNA即可導(dǎo)致金電極上大量cDNA被切割，從而放大反應(yīng)信號(hào)。最后，電極上未被切割的cDNA可與修飾大量報(bào)告DNA的金納米粒子雜交并吸附甲基藍(lán)產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。利用該傳感器檢測(cè)OTA，其LOD為5 pg/mL。

3 核酸定量型適配體傳感器

由于痕量核酸的定量技術(shù)已非常成熟，而適配體傳感器的競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物是DNA，MODH等[46]開(kāi)發(fā)了一種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的OTA檢測(cè)方法。該方法利用cDNA將適配體結(jié)合至納米磁珠表面，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)后通過(guò)qPCR技術(shù)對(duì)磁吸后上清中的游離適配體進(jìn)行擴(kuò)增和定量。該OTA傳感器具有極寬線性檢測(cè)范圍，可達(dá)0.039～1 000 ng/mL，其LOD為9 pg/mL。雖然此類基于核酸定量的檢測(cè)方法具有檢測(cè)范圍寬、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但其需要昂貴的定量PCR儀、耗時(shí)長(zhǎng)且檢測(cè)成本較高。

4 其他

與上述需要大型儀器的檢測(cè)方法不同，基于廉價(jià)的商業(yè)化便攜式血糖儀的生物傳感器價(jià)格低廉，可被廣泛用于非葡萄糖待測(cè)物的低成本現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[47]。如GU等[48]將蔗糖酶標(biāo)記的cDNA通過(guò)OTA適配體與磁珠結(jié)合制備檢測(cè)探針。當(dāng)OTA存在時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)釋放的蔗糖酶-cDNA復(fù)合物可催化蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。此時(shí)利用血糖儀測(cè)定體系中葡萄糖的濃度,即可實(shí)現(xiàn)非葡萄糖目標(biāo)物的間接定量檢測(cè)。使用該方法檢測(cè)紅酒中的OTA，其LOD為3.66 ng/mL。QIU等[49]則在上述檢測(cè)探針中的適配體和cDNA末端分別修飾疊氮和炔基官能團(tuán)，以利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)減少cDNA的非特異性釋放，從而降低背景信號(hào)、提高檢測(cè)靈敏度，其LOD降至72 pg/mL。該類檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快捷且成本低，適用于食品的大規(guī)模監(jiān)測(cè)篩查。

5 展望

綜上所述，基于磁性納米材料的OTA適配體傳感器多以通過(guò)適配體/cDNA結(jié)合的納米磁珠-信號(hào)分子復(fù)合物作為檢測(cè)探針。由于納米磁珠表面積大且可分散在檢測(cè)體系中，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)可高效進(jìn)行。同時(shí)，通過(guò)磁分離可快速分離/富集競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)產(chǎn)物或原始檢測(cè)探針用于信號(hào)檢測(cè)。此外，在電化學(xué)傳感器中納米磁珠可方便快速地富集至電極表面,提供并增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，而通過(guò)移除磁珠又可快速更新電極表面,實(shí)現(xiàn)電極的重復(fù)使用。由于以適配體作為生物識(shí)別元件，已報(bào)道的穩(wěn)定性分析表明，OTA適配體傳感器具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性。在提高檢測(cè)靈敏度方面，隨著納米材料的快速發(fā)展，各類新型納米光學(xué)材料、納米模擬酶和納米組裝體被用于增強(qiáng)基于磁珠的適配體傳感器的光/電信號(hào)輸出。此外，基于適配體傳感器中競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)產(chǎn)物是DNA分子這一特點(diǎn)，成熟的DNA擴(kuò)增技術(shù),如RCA技術(shù)和PCR技術(shù)，以及基于各類核酸酶的新型核酸信號(hào)放大策略,均可引入適配體傳感器的信號(hào)生成或傳導(dǎo)體系中,以放大檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。

雖然已有的基于磁性納米材料的OTA適配體傳感器有較高的檢測(cè)靈敏度，但其仍有可改進(jìn)之處。例如,現(xiàn)有方法大多需要大型、昂貴的光學(xué)、電化學(xué)或核酸擴(kuò)增定量檢測(cè)設(shè)備且設(shè)備操作復(fù)雜，不適于基層企業(yè)或監(jiān)測(cè)部門(mén)的大規(guī)模現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。與大型檢測(cè)儀器相比，智能手機(jī)檢測(cè)平臺(tái)具有檢測(cè)設(shè)備體積小、便于攜帶、成本低且可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)遠(yuǎn)程檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已與多種光學(xué)或電化學(xué)檢測(cè)方法聯(lián)用,用于待測(cè)物的分析。而將檢測(cè)過(guò)程集成在微流芯片中進(jìn)行的微流控檢測(cè)平臺(tái)也具有成本低、使用和攜帶方便及樣品用量小等優(yōu)點(diǎn)。上述檢測(cè)平臺(tái)與免疫層析試紙條檢測(cè)一樣,均適于大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，應(yīng)將其更多的應(yīng)用于基于磁性納米材料的真菌毒素適配體傳感器。此外，磁性材料不僅可用于磁分離，亦可作為磁信號(hào)探針使用。由于穿透性強(qiáng)，且樣品基質(zhì)一般無(wú)磁信號(hào)不會(huì)形成背景干擾，磁信號(hào)在復(fù)雜食品樣品分析中具有良好的應(yīng)用前景，且十分適于作為基于磁性納米材料的真菌毒素適配體傳感器的檢測(cè)信號(hào)。