鄭曉杰，林勝利，吳聰聰，聶小華

1(溫州科技職業(yè)學(xué)院(溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院)，浙江 溫州，325006) 2(文成縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)研究院，浙江 溫州，325006) 3(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja)，又名青錢李、搖錢樹和麻柳等，是我國特有的胡桃科青錢柳屬藥食同源植物，主要生長于我國湖南、江西、浙江、福建、貴州等地，其嫩葉在民間常用于制作甜茶飲料，可清熱解暑和生津止渴。已有研究表明，青錢柳葉含有豐富的酚類物質(zhì)，如咖啡酸、槲皮素、山奈酚及其衍生物等[1-2]，槲皮素和山奈酚含量[3]均高于其他22種果蔬和植物[4]；且青錢柳葉酚類物質(zhì)可降低體內(nèi)氧化應(yīng)激，具有保護(hù)組織氧化損傷的功效[5-6]。2013年，青錢柳葉被國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)為新食品原料，與其相關(guān)的保健茶與保健食品相繼出現(xiàn)。

酚類物質(zhì)是植物中重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，它的積累與種源、產(chǎn)地和采收期等有著密切關(guān)聯(lián)[7]。由于產(chǎn)地環(huán)境和采收時(shí)間的不同，青錢柳生理生化進(jìn)程可能不一致，酚類物質(zhì)組成與含量由此發(fā)生變化，不同地理種源青錢柳葉中酚類物質(zhì)及抗氧化活性存在較大差異[8-9]。當(dāng)前青錢柳人工種植已成為趨勢(shì)，現(xiàn)有研究多集中于種源評(píng)價(jià)[8-9]、種植條件等[10-11]，探究同種源不同產(chǎn)地青錢柳嫩葉抗氧化物質(zhì)積累情況，對(duì)于青錢柳資源的開發(fā)利用極為重要。本課題組以浙江文成和湖南張家界兩地的同種源5年生青錢柳為試驗(yàn)材料，采用體外抗氧化方法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法，剖析5月中旬～9月中旬嫩葉自由基清除能力、總還原力、總酚含量、總黃酮含量、酚類物質(zhì)組成與含量等動(dòng)態(tài)變化，并通過相關(guān)分析明確酚類物質(zhì)對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

1.1.1 主要材料與藥品

2018年5月中旬～9月中旬采集浙江文成(WC)、湖南張家界(ZJJ)兩地的青錢柳枝條中上部嫩葉，經(jīng)60 ℃干燥、粉碎和60目篩分后，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩Ｆ渲衂JJ青錢柳是浙江文成栽培基地(即WC青錢柳)的引進(jìn)種源。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]；(+)-兒茶素、 2,3-O-二咖啡酰酒石酸、4-O-咖啡酰奎寧酸、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷，Sigma-Aldrich公司、美國Sigma- Aldrich公司；抗壞血酸、沒食子酸、蘆丁和福林酚試劑，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

CS-700磨粉機(jī)，浙江武義海納電器有限公司；Mas-2微波萃取儀，上海新儀微波化學(xué)技術(shù)科技有限公司；CR22N/CR21N高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；752型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。Ultimate 3 000 HPLC - Q Exactive液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Thermo Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青錢柳葉的微波輔助乙醇提取

青錢柳葉粗粉經(jīng)石油醚脫脂處理后，揮發(fā)去除石油醚；按料液比1∶30(g∶mL)加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，進(jìn)行微波提取，微波功率500 W，50 ℃下提取10 min；提取2次，合并提取物。

1.2.2 DPPH清除能力測(cè)定

參照LIU等[9]的方法。2.0 mL樣液中加入等體積0.1 mmol/L DPPH溶液，混勻，室溫避光放置30 min，515 nm下測(cè)定其吸光度。以抗壞血酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，DPPH清除能力以每克青錢柳干樣品(dry matter, DM)中所含抗壞血酸當(dāng)量(ascorbic acid equivalent, AAE)表示 (μmol AAE/g·dm)。

1.2.3 ABTS清除能力測(cè)定

1.2.4 總還原能力測(cè)定

采用鐵氰化鉀還原法[12]。2.0 mL樣液中加入等體積0.2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 6.5)和10 g/L鐵氰化鉀，混勻，50 ℃下反應(yīng)20 min，加入1 mL 100 g/L三氯乙酸和0.4 mL 1 g/L FeCl3，混勻，靜置10 min，700 nm下測(cè)定其吸光度。以抗壞血酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 總還原能力以1 g青錢柳干樣品中所含抗壞血酸當(dāng)量(gallic acid equivalent, GAE)表示 (μmol GAE/g dm)。

1.2.5 總酚的測(cè)定

采用福林酚法測(cè)定[13]。0.5 mL樣液中加入2.5 mL 0.2 mol/L福林酚試劑，混勻靜置5 min后加入2.0 mL 75 g/L Na2CO3，混勻后靜置60 min，765 nm下測(cè)定其吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，總酚含量以1 g青錢柳葉干樣品中所含沒食子酸當(dāng)量表示(μmol GAE/g dm)。

1.2.6 總黃酮含量測(cè)定

采用三氯化鋁法[8]測(cè)定。0.5 mL樣液中加入2.0 mL體積分?jǐn)?shù)30%乙醇和2.0 mL 10 g/L AlCl3，混勻，靜置10 min，420 nm下測(cè)定其吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，總黃酮含量以1 g青錢柳葉干樣品中所含蘆丁當(dāng)量(rutin equivalent, RE)表示(mg RE/g dm)。

1.2.7 HPLC- MS/MS分析

色譜條件：Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫程序：流動(dòng)相初始10% B，保持5 min，5～25 min內(nèi)B濃度升至90%，保持8 min，最后7 min內(nèi)降低至5% B；流速0.8 mL/min，上樣體積5 μL，柱溫40 ℃，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)波長200～400 nm。

質(zhì)譜條件：采用HESI離子源，負(fù)離子模式，噴霧電壓3.2 kV；翹氣速率40 mL/min，輔助氣速率10 mL/min；毛細(xì)管溫度300 ℃，S-lens 50%，掃描模式Full ms/dd-ms2 top5；一級(jí)掃描分辨率70 000，范圍100～1 500m/z；二級(jí)掃描分辨率17 500，起始離子50m/z。采用離子峰和碎片離子峰特征進(jìn)行MIST數(shù)據(jù)庫檢索。

以2,3-O-二咖啡酰酒石酸、4-O-咖啡?？鼘幩帷?+)-兒茶素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-新橘皮糖苷為標(biāo)準(zhǔn)物，采用上述色譜條件進(jìn)行定量分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

每組樣品平行測(cè)定3次, 均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算及作圖采用Excel軟件；采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化

DPPH法、ABTS法和總還原能力是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的常用指標(biāo)，由此體現(xiàn)其供氫能力或供電子能力，浙江文成(WC)和湖南張家界(ZJJ)兩地的同種源青錢柳葉抗氧化活性如圖1所示。結(jié)果表明，青錢柳葉提取物可有效清除DPPH和ABTS自由基以及還原Fe3+成Fe2+，且存在著采收期變異性和產(chǎn)地變異性。隨著采收時(shí)間的延遲，WC青錢柳葉DPPH清除能力、ABTS清除能力和總還原能力均呈現(xiàn)先增后降的動(dòng)態(tài)變化，8月達(dá)到峰值，分別為162.26、214.04 和188.33 μmol AAE/g dm；ZJJ青錢柳葉上述3種抗氧化活性則表現(xiàn)為增加-降低-增加的雙峰態(tài)分布特征，其最大峰值分別為141.88(9月)、196.68(9月)和166.44 μmol AAE/g dm (6月)。據(jù)報(bào)道，植物提取物的抗氧化活性變化曲線以單峰為主，但也存在雙峰或多峰分布，其動(dòng)態(tài)變化也可能存在不一致性[12,14]，這主要是因?yàn)椴煌a(chǎn)地和采收期下，植物體內(nèi)酚類物質(zhì)組成與含量不同[7]，化學(xué)結(jié)構(gòu)在很大程度上影響著酚類物質(zhì)的抗氧化性[14-15]。與ZJJ相比，WC青錢柳葉在7、8月具有較高的自由基清除能力和總還原能力。從抗氧化活性角度出發(fā)，WC青錢柳葉在8月采收最佳，而ZJJ青錢柳葉在6月和9月采收比較合適。

圖1 青錢柳葉自由基清除能力和還原力的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Variation of radical scavenging activity and reducing power in C. Paliurus leaves

2.2 抗氧化物質(zhì)積累的動(dòng)態(tài)變化

酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，其積累受到植物種源、產(chǎn)地和采收期等諸多因素影響[3-6]。浙江文成和湖南張家界兩地的同種源青錢柳葉中總酚和總黃酮的積累如圖2所示。隨著采收時(shí)間的延遲，WC青錢柳葉總酚含量、總黃酮含量表現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)，均在8月達(dá)到峰值，分別為44.38 mg GAE/g dm和27.96 mg RE/g dm。ZJJ青錢柳總酚含量則在5～9月采收期內(nèi)呈雙峰態(tài)特征，9月達(dá)到最大峰值(40.56 mg GAE/g dm)；總黃酮含量在5～8月內(nèi)無明顯變化，基本在19.14～20.84 mg RE/g dm范圍內(nèi)波動(dòng)，然后快速增加到25.78 RE/g dm(9月)，該結(jié)果有別于FANG等[3]和柏明娥等[16]報(bào)道，但ZHANG等[13]也發(fā)現(xiàn)杜仲葉中黃酮與多酚的積累表現(xiàn)出不同的采收變化規(guī)律。與ZJJ青錢柳葉相比，WC青錢柳葉7月和8月積累大量的多酚類物質(zhì)，5～8月內(nèi)積累較多的黃酮類化合物。

圖2 青錢柳葉中酚類物質(zhì)積累的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Variation of phenolic accumulation inC. Paliurus leaves

上述結(jié)果說明青錢柳葉中酚類物質(zhì)的積累不僅受采收期影響，同時(shí)存在明顯的產(chǎn)地差異。這是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)作為植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，隨著生長時(shí)間的推移，其單體組成與含量隨之發(fā)生變化，且與生長環(huán)境密切相關(guān)[7]。為了獲得較高含量的酚類物質(zhì)，WC青錢柳葉8月采收最佳，而ZJJ青錢柳葉以6月和9月采收比較合適。

2.3 酚類物質(zhì)的定性和定量分析

考慮到浙江文成和湖南張家界兩地的同種源青錢柳葉分別在8月和6月達(dá)到抗氧化活性的峰值，本文采用HPLC-MS/MS 法對(duì)其提取物進(jìn)行物質(zhì)的定性分析，結(jié)果如表1所示。青錢柳葉提取物中初步鑒定出12種酚類物質(zhì)，分別為2,3-O-二咖啡酰酒石酸、4-O-咖啡?？鼘幩?、(+)-兒茶素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、槲皮素-3,4′-二甲醚、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷、四甲基木犀草素、3′,4′-二羥基-α-萘黃酮、圣草酚-7-O-葡萄糖苷和3′,4′-二甲氧基-2′-羥基查爾酮。其中4-O-咖啡?？鼘幩帷㈤纹に?3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷已在青錢柳葉被廣泛檢出[8-11]，張曉瑢等[17]也在青錢柳葉中分離鑒定出(+)-兒茶素，但2,3-O-二咖啡酰酒石酸、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷等尚未有相關(guān)報(bào)道。進(jìn)一步對(duì)2,3-O-二咖啡酰酒石酸、4-O-咖啡?？鼘幩?、(+)-兒茶素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-新橘皮糖苷等7種物質(zhì)進(jìn)行積累量分析，結(jié)果如表2所示。其中(+)-兒茶素僅在WC青錢柳葉中檢出，山奈酚-3-O-葡萄糖苷僅在8月采集的ZJJ青錢柳葉中檢出；4-O-咖啡?？鼘幩崾乔噱X柳葉中主要積累的酚類物質(zhì)，其次為槲皮素-3-O-鼠李糖苷、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷和2，3-O-二咖啡酰酒石酸。同種源、不同產(chǎn)地的青錢柳葉不僅在酚類的組成上存在很大的差距，且其積累量也存在很大差異，這與采收期密切關(guān)聯(lián)。魏娜等[18]也指出，同一品種、不同生態(tài)區(qū)域的青稞中黃酮和花青素差異顯著。

表1 青錢柳葉提取物中酚類物質(zhì)的定性分析Table 1 Qualitative analysis of phenolic compounds in C. paliuru leaves

表2 青錢柳葉提取物中酚類物質(zhì)積累量的變化 單位：mg/g

注；a～d表示同一種物質(zhì)在不同采收時(shí)間的含量存在顯著性差異(P<0.05);nd表示未檢出

2.4 青錢柳葉酚類物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性分析

采用Pearson相關(guān)分析法評(píng)價(jià)青錢柳葉中總酚、總黃酮、共同存在的酚類物質(zhì)(2,3-O-二咖啡酰酒石酸、4-O-咖啡?？鼘幩?、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-新橘皮糖苷)等含量與抗氧化活性的相關(guān)性，結(jié)果如表4所示。青錢柳葉的3種抗氧化活性(DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、還原力)均與總酚含量、2,3-O-二咖啡酰酒石酸含量存在著高度的正相關(guān) (r=0.910～0.982)，與總黃酮含量、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷含量存在著一定程度的相關(guān)性(r=0.448～0.683)；但與4-O-咖啡?？鼘幩岷烷纹に?3-O-鼠李糖苷的含量之間相關(guān)性很低，r僅為0.158～0.330。相關(guān)性分析說明總酚和總黃酮是青錢柳葉抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中2,3-O-二咖啡酰酒石酸起著較為重要的作用；這和LIU等[9]、CAO等[14]的研究有所不同。但早期研究表明2,3-O-二咖啡酰酒石酸具有良好的抗氧化活性，可有效清除自由基[25-26]。

表3 青錢柳葉酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性的相關(guān)分析Table 3 Pearson correlation between antioxidant capacityand phenolic compound content of C. paliurus leaves

注： * 和 **分別表示顯著性差異P<0.05和P<0.01

3 結(jié)論

青錢柳是廣泛分布于我國南方的藥食同源植物，由于天然資源的不足，引進(jìn)優(yōu)良種源進(jìn)行人工栽培已成為趨勢(shì)。浙江文成和湖南張家界兩地的青錢柳為同一種源，且產(chǎn)地的地理環(huán)境較為接近(緯度、年平均氣溫和年降雨量)，但其抗氧化活性、總酚含量和總黃酮含量隨采收期的延遲依然表現(xiàn)出截然不同的變化趨勢(shì)，酚類物質(zhì)組成及其積累量也存在著很大的差異，這說明產(chǎn)地對(duì)青錢柳葉抗氧化物質(zhì)有著很大的影響。因此，引進(jìn)優(yōu)良種源的同時(shí)，宜根據(jù)產(chǎn)地適當(dāng)調(diào)整采收期, 以滿足青錢柳葉質(zhì)量控制和后期開發(fā)。此外，總酚和總黃酮是青錢柳葉抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中2,3-O-二咖啡酰酒石酸起到較為重要的作用。