李冠龍，劉曉蘭，鄭喜群

1(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 2(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶, 163319) 3(黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

心腦血管疾病的發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，已經(jīng)成為導(dǎo)致全球人口死亡的首要原因[1-3]。纖維蛋白是由凝血酶和一系列凝血因子作用于可溶性纖維蛋白原形成的不溶性蛋白成分，它在血管內(nèi)的聚集是引起上述血栓性疾病的主要原因之一[4-5]。

纖溶酶是一種蛋白水解酶，可以催化纖維蛋白水解，達(dá)到溶解血栓的目的[4]。含纖溶因子的功能性食物具有增加人體纖溶系統(tǒng)活性的功能[6]。有計(jì)劃地食用含纖溶因子的功能食品，可使體內(nèi)纖溶系統(tǒng)活性緩慢適量增強(qiáng)，逐漸恢復(fù)其正常生理狀態(tài)，降低血栓傾向[7]。

食用菌廣泛分布于世界各地，它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥物特性被廣泛使用[8]。食用菌產(chǎn)生的生物活性分子主要有多糖、葡聚糖、萜類化合物凝集素、他汀類等，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤和其他藥效[9-10]。對(duì)來(lái)自食用菌的纖維蛋白溶解酶的溶栓抗栓作用研究受到廣泛關(guān)注。迄今為止，已報(bào)道從多種食用菌中提取獲得纖溶酶，如蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)[11-13]、香菇(Lentinusedodes)[14]、冬蟲夏草(Cordycepssinensis)[15]、阿魏菇(Pleurotusferulae)[16]、平菇(Pleurotusostreatus)[17]等。

茶樹菇是一種生長(zhǎng)于亞熱帶地區(qū)的土生木腐菌，營(yíng)養(yǎng)極其豐富，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)19.55%，具備人體必需的8種氨基酸，并且有豐富的B族維生素和鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等營(yíng)養(yǎng)元素。研究表明，茶樹菇具有抗氧化、提高免疫力和抗腫瘤等作用，極具開發(fā)潛力[18-19]。在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，茶樹菇子實(shí)體提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶解纖維蛋白的能力，但茶樹菇來(lái)源的纖維蛋白溶解酶未見報(bào)道。本研究嘗試從茶樹菇子實(shí)體中提取、純化纖溶酶，并且對(duì)其體外的溶栓活性和抗凝活性進(jìn)行研究，為以茶樹菇為功能性食品基料，用于開發(fā)預(yù)防具有血栓傾向的心腦血管疾病的功能食品奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹菇子實(shí)體，古田縣天鮮農(nóng)產(chǎn)品有限公司；Sephadex G-25凝膠填料、CM- Fast Flow離子交換色譜填料、Source 15PHE疏水填料、Mono S 5/50離子填料，美國(guó)GE公司；牛血清白蛋白、(NH4)2SO4(色譜純)、NaCl(色譜純)、SDS-PAGE電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白,上海生工生物工程公司；纖維蛋白原和凝血酶，上海經(jīng)科生物有限公司；其他試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S電子天平和PB-10酸度計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；CR21G高速冷凍離心機(jī)，日立公司；TU1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(prime)和AKTA Avant蛋白純化系統(tǒng)，美國(guó)GE公司；粉碎機(jī)，山東金普分析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)濃度和纖溶酶酶活力測(cè)定

采用Folin-酚法[20]測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，檢測(cè)640 nm下的吸光值；纖溶酶活力的測(cè)定參考ASTRUP等[21]血纖維蛋白平板法，待測(cè)液體在37 ℃條件下反應(yīng)6 h，測(cè)量溶圈直徑，計(jì)算酶活力。

1.3.2 ACase的分離純化

(1)粗酶液制備：茶樹菇子實(shí)體晾干粉碎，取40 g子實(shí)體粉末以1∶10 (g∶mL)比例加入生理鹽水，4 ℃下浸提6 h，4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液置于4 ℃冰箱中備用。

(2)鹽析曲線的制作：取18個(gè)5 mL的離心管，每管加入2 mL上述離心后的上清液，向管中加入(NH4)2SO4，調(diào)整(NH4)2SO4飽和度分別至0%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%，將混勻溶解的鹽析液置于4 ℃冰箱中鹽析12 h，在4 ℃，10 000 r/min條件下離心得上清液和沉淀，沉淀用2 mL 0.02 mol/L的PBS緩沖溶液 (pH 6.0)溶解，分別測(cè)定不同(NH4)2SO4飽和度的上清液以及沉淀樣品的纖溶酶酶活力和蛋白含量，繪制(NH4)2SO4鹽析曲線。

(3)硫酸銨鹽析：取離心后上清液加入硫酸銨0.516 g/mL，4 ℃鹽析過(guò)夜，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，棄去上清液，沉淀用50 mL 0.02 mol/L PBS (pH 6.0)緩沖液溶解，置于4 ℃冰箱中備用。

(4)Sephadex G-25凝膠色譜：將樣品用Sephadex G-25凝膠色譜進(jìn)行脫色和交換緩沖溶液，洗脫液為0.02 mol/L PBS (pH 6.0)緩沖液，收集活性組分。

(5)CM-Sepharose Fast Flow弱陽(yáng)離子交換色譜：先用0.02 mol/L PBS(pH 6.0)緩沖液平衡，上樣后用含0～0.8 mol/L NaCl的相同緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集活性組分。

(6)Source 15PHE疏水相互作用色譜：先用含(NH4)2SO4飽和度10%的0.02 mol/L PBS (pH 7.4)緩沖溶液平衡，上樣后先用上述緩沖液洗脫，進(jìn)一步用含(NH4)2SO4飽和度10%～0%的0.02 mol/L PBS (pH 7.4)緩沖溶液進(jìn)行線性洗脫，收集活性組分。

(7)Mono S 5/50強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜：將上一步收集的活性組分透析脫鹽，用Mono S 5/50離子交換色譜進(jìn)行最后一步分離，先用0.02 mol/L PBS (pH 5.5)緩溶液平衡，洗脫液為含0.02 mol/L PBS (pH 5.5)緩溶液。上樣后用含0～0.8 mol/L NaCl的該緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集活性組分，檢測(cè)纖溶酶純度。

1.3.3 ACase的純度和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

參考LIU等[12]的方法。采用Native-PAGE電泳，觀察樣品是否為單一條帶判斷樣品純度；參考張?chǎng)┦娴萚22]方法，采用SDS-PAGE電泳垂直板凝膠測(cè)定ACase的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.4 ACase的N-端序列測(cè)定

采用Edman降解法測(cè)定ACase的N-端序列，將色譜分離后的樣品送到上海新生命有限公司測(cè)序。

1.3.5 ACase對(duì)人血纖維蛋白原的降解

參考LIU等[12]的方法。取10支0.5 mL離心管，分別加入23 μL 20 mg/mL人血纖維蛋白原和23 μL 0.112 mg/mL ACase，置于37 ℃保溫，分別于1、3、5、10、20、30 min、1、1.5、2、3、4和6 h后各取1管，迅速向反應(yīng)體系中加入46 μL樣品緩沖液，再加入10 μL β-巰基乙醇，沸水浴5 min滅活終止反應(yīng)后，進(jìn)行電泳分析。

1.3.6 ACase體外抗凝血作用研究

參考LIU等[12]的方法。分別取500 μL ACase (110 U/mL)、生理鹽水正常對(duì)照組和肝素鈉抗凝劑 (100 U/mL)陽(yáng)性對(duì)照組于滅菌的1.5 mL 離心管中，分別加入正常大鼠血1 mL，輕輕搖勻，37 ℃水浴計(jì)時(shí)，每隔5 s傾斜離心管1次，觀察表層血液是否沿離心管移動(dòng)，至凝固時(shí)停止計(jì)時(shí)，計(jì)為體外凝血時(shí)間。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離純化

2.1.1 硫酸銨鹽析

鹽析是指向溶液中加入無(wú)機(jī)鹽類(如(NH4)2SO4、NaCl等)改變蛋白質(zhì)的溶解性，使其析出沉淀的過(guò)程。鹽析作為蛋白質(zhì)純化過(guò)程中的粗提純方式被廣泛應(yīng)用。此方法操作簡(jiǎn)便，條件溫和，并且在鹽析的過(guò)程中不會(huì)造成蛋白質(zhì)的變性或失活。茶樹菇纖溶酶鹽析曲線結(jié)果如圖1所示。

圖1 纖溶酶鹽析曲線圖譜Fig.1 Salting out curve of the fibrinolytic enzyme

隨著(NH4)2SO4飽和度的逐漸增加，上清液中纖溶酶比活力逐漸降低，沉淀中纖溶酶比活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)(NH4)2SO4飽和度為80%時(shí)，溶液有明顯的絮狀沉淀分層，此時(shí)，沉淀中纖溶酶比活力達(dá)到最大，此條件下上清液中的酶活力幾乎為0，有少量的蛋白存在，沉淀中的酶活力較粗酶液中沒有較大損失，但蛋白含量明顯減少，比活力有所提高。說(shuō)明在此條件下，鹽析可以有效地除去部分雜蛋白，同時(shí)使粗酶液濃縮，減小純化體系，易于后續(xù)操作。

2.1.2 粗酶液脫色

粗酶液中存在一些色素物質(zhì)，在酶的分離過(guò)程中色素會(huì)吸附到各種色譜填料上不易洗脫，污染填料從而降低填料的載量和使用壽命。因此，在進(jìn)行酶的色譜分離之前要先除去多數(shù)的色素物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用Sephadex G-25凝膠對(duì)鹽析后的酶液進(jìn)行脫色并將酶液中的(NH4)2SO4除去。Sephadex G-25分離鹽析后纖溶酶樣品中色素的洗脫曲線如圖2所示。

如圖2所示，蛋白峰和活性峰相對(duì)應(yīng)，纖溶酶最先被洗脫下來(lái)，說(shuō)明纖溶酶的分子質(zhì)量大于5 000 kDa，Sephadex G-25的色素物質(zhì)在洗脫結(jié)束的時(shí)候出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了纖溶酶和色素物質(zhì)的分離。同時(shí)，該步還能夠有效地去除溶液中的高濃度(NH4)2SO4，為接下來(lái)的離子交換色譜的低鹽上樣條件做準(zhǔn)備。雖然樣品溶液被稀釋，但考慮到CM-Sepharose Fast Flow離子交換層析具有濃縮的作用，該步的效果還是很理想的。此步驟只是對(duì)蛋白樣品進(jìn)行脫鹽和脫色，不涉及到雜蛋白的去除。

圖2 Sephadex G-25凝膠過(guò)濾色譜洗脫曲線Fig.2 Elution curve of Sephadex G-25 gel filtrationchromatography

2.1.3 ACase的色譜純化

考慮到待分離樣品酶濃度較低，含有一定鹽的特點(diǎn)，利用目的蛋白和雜蛋白之間等電點(diǎn)和疏水性的差異，順次采用CM-Sepharose FF弱陽(yáng)離子交換色譜、Source 15PHE疏水相互作用色譜和Mono S強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜對(duì)樣品進(jìn)行分離純化。

用CM-Sepharose Fast Flow弱陽(yáng)離子交換色譜分離脫色后樣品中纖溶酶的洗脫曲線如圖3所示。

圖3 CM-Sepharose Fast Flow弱陽(yáng)離子交換色譜洗脫曲線Fig.3 Elution curve of CM-Sepharose Fast Flow IEC

通過(guò)離子交換色譜分離該纖溶酶的預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣品和緩沖液pH值為6.5時(shí)，纖溶酶的帶正電荷量較少，酶不能與CM-Sepharose FF填料結(jié)合，繼續(xù)降低樣品和緩沖液pH至6.3和6.0，發(fā)現(xiàn)pH值為6.0時(shí)，纖溶酶可以與填料結(jié)合。由圖3可以看出，纖溶酶在離子強(qiáng)度為0～0.8 mol/L線性洗脫階段被洗脫下來(lái)，蛋白峰和酶活性峰相對(duì)應(yīng)，分離效果較好。試驗(yàn)結(jié)果還表明，該纖溶酶在pH值為6.0的條件下帶正電荷，其等電點(diǎn)pI一定大于6.0。

將經(jīng)離子交換色譜分離后收集的活性組分透析交換緩沖溶液，透析液為此步驟的起始緩沖溶液，然后進(jìn)行Source 15PHE疏水層析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 Source 15PHE疏水相互作用色譜洗脫曲線Fig.4 Elution curve of Source 15PHE HIC

由圖4可以看出，在此條件下，纖溶酶與疏水性填料結(jié)合較好，未與填料結(jié)合的疏水性較弱的雜蛋白在上樣后的恒洗階段被洗脫下來(lái)，纖溶酶在(NH4)2SO4飽和度降低的線性洗脫結(jié)束后被分離出來(lái)，表明纖溶酶的疏水性較強(qiáng)，與填料結(jié)合的較牢固，蛋白峰與酶活性峰對(duì)應(yīng)良好，分離效果較為理想。

將Source 15PHE疏水層析分離后收集的活性組分透析脫鹽、凍干后，進(jìn)行了Mono S強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜,用此步驟的起始緩沖液溶解后上樣，分離結(jié)果如圖5所示。

圖5 Mono S離子交換色譜洗脫曲線Fig.5 Elution curve of Mono S IEC

上樣后，未與填料結(jié)合的雜蛋白直接被洗脫下來(lái)，隨著鹽離子濃度增加，在線性洗脫的過(guò)程中出現(xiàn)了一個(gè)峰形對(duì)稱性較好的蛋白峰，經(jīng)檢測(cè)該峰具有纖溶活性，且與蛋白峰完全對(duì)應(yīng)，說(shuō)明此纖溶酶的純化已經(jīng)達(dá)到較好的效果，酶得到更加精細(xì)的純化。

綜上所述，通過(guò)鹽析、Sephadex G-25凝膠色譜、CM-Sepharose FF離子交換色譜、Source 15PHE疏水色譜和Mono S離子交換色譜對(duì)茶樹菇子實(shí)體中的纖溶酶進(jìn)行分離純化，獲得了較好的效果。ACase的活力回收率和純化情況統(tǒng)計(jì)如表1所示。

表1 茶樹菇纖溶酶純化統(tǒng)計(jì)Table 1 Purification steps of the fibrinolytic enzyme fromAgrocybe aegerita

注：表中數(shù)據(jù)為40 g子實(shí)體粉末提取

從表1可知，經(jīng)多步提純后目標(biāo)纖溶比活力由7.01 U/mg提高到1 731.05 U/mg，活力回收率為12.66%，總純化倍數(shù)為246.94倍，得到了較好的分離。

2.2 理化分析

2.2.1 ACase的純度分析

用Native-PAGE檢驗(yàn)經(jīng)純化后ACase的純度情況，結(jié)果如圖6所示。ACase在 Native-PAGE電泳中呈單一條帶，表明樣品已經(jīng)達(dá)到了電泳純，將膠條放置在血纖維蛋白平板上，在37 ℃保溫孵育，發(fā)現(xiàn)在血纖維蛋白平板中對(duì)應(yīng)的凝膠條帶處出現(xiàn)透明帶，說(shuō)明該條帶具有纖溶活性，為目標(biāo)蛋白。

1-Native-PAGE電泳;2-血纖維蛋白平板印跡活性圖6 Native-PAGE電泳圖和血纖維蛋白平板印跡活性Fig.6 Native-PAGE and the fibrinolytic zymogram onfibrin plate of the ACase

2.2.2 ACase的相對(duì)分子質(zhì)量確定

ACase的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，ACase在變性電泳中顯示出2條帶，由SDS-PAGE電泳原理可知，在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，分子間和分子內(nèi)的氫鍵斷裂，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子被解聚、組成它們的多肽鏈[22]。在Native-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)測(cè)定到樣品為單一組分，這些試驗(yàn)結(jié)果表明，ACase是由2個(gè)亞基組成。凝膠成像系統(tǒng)的Labworks軟件分析出該2個(gè)亞基相對(duì)分子質(zhì)量約為31.4 kDa和21.2 kDa。

泳道1-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maeker;泳道2-ACase圖7 ACase的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.7 SDS-PAGE of the ACase

目前已報(bào)道的纖溶酶分子質(zhì)量分布范圍較廣，已報(bào)道纖溶酶的大多數(shù)為單亞基蛋白，鮮有二聚體蛋白。僅有DENG等[23]從脈孢霉發(fā)酵產(chǎn)物中提取的纖溶酶為二聚體蛋白，分子質(zhì)量分別為30 kDa和17.5 kDa。臧婉婷等[15]從冬蟲夏草固態(tài)培養(yǎng)菌絲中提取的纖溶酶OSP-1由2個(gè)亞基組成，相對(duì)分子質(zhì)量分別為27.60 kDa和23.83 kDa。

2.2.3 ACase的N-端序列分析

經(jīng)過(guò)Edman法對(duì)2個(gè)亞基的N-端12個(gè)氨基酸進(jìn)行測(cè)定，亞基1(31.4 kDa)的序列為AIVTQTNAPWGL，亞基2(21.2 kDa)的序列為SNADGNGHGTHV。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)該纖溶酶為一種新型纖溶酶。

表2 茶樹菇纖溶酶N-端序列與NCBI已知酶的對(duì)比情況Table 2 Comparison of N-terminal sequence of fibrinolyticenzyme from Agrocybe aegerita

2.3 溶栓抗凝性分析

2.3.1 Acase對(duì)人血纖維蛋白原的降解作用

ACase對(duì)人血纖維蛋白原的降解情況如圖8所示。纖維蛋白原由α、β和γ三個(gè)亞基組成，ACase可以降解人血纖維蛋白原，其降解各亞基的次序?yàn)棣恋慕到馑俾蚀笥讦潞挺脕喕?。在反?yīng)1 min后茶樹菇纖溶酶將人血纖維蛋白原的α鏈完全降解，10 min后人血纖維蛋白原的β鏈降解完全，γ鏈在1.5 h后完全降解。這一降解順序與人纖溶酶降解纖維蛋白原各亞基的情況基本一致。

圖8 ACase對(duì)人血纖維蛋白原的降解情況Fig.8 Process of human fibrinogen degradation by the ACase

已報(bào)道的外源纖溶酶中，只有一部分可以降解纖維蛋白原的3個(gè)亞基,來(lái)源于銀耳和糙皮側(cè)耳的纖溶酶被發(fā)現(xiàn)可以降解纖維蛋白原的α和β鏈，但不能降解γ鏈[24-25]；來(lái)源于猴頭菌的纖溶酶[26]只能降解α和γ鏈，而不能降解β鏈；但來(lái)源于蛹蟲草菌[27]的纖溶酶能夠先降解纖維蛋白原的α鏈，緊隨其后的是γ鏈，最后是β鏈。本研究中的ACase與LIU等[12]純化的蛹蟲草纖溶酶相似，可水解纖維蛋白原的3個(gè)亞基，其降解的順序?yàn)棣?、β和γ鏈?/p>

2.3.2 ACase體外抗凝血作用

將ACase與血液混合后置于37 ℃水浴保溫，記錄血液凝固時(shí)間。加入血液后，生理鹽水對(duì)照組509 s后全部凝固，肝素鈉陽(yáng)性對(duì)照組和ACase組在4 h內(nèi)均未凝固；24 h后，肝素鈉陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)了含量不等的部分血塊，而ACase組仍未出現(xiàn)血凝塊，且血液流動(dòng)性較好，抗凝效果非常顯著，結(jié)果表明，該酶具有明顯的抗凝血作用，其抗凝血活性明顯高于肝素。

3 結(jié)論

本研究從茶樹菇子實(shí)體中分離純化得到一種纖溶酶ACase，經(jīng)N-端序列測(cè)定比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該酶為一種新型纖溶酶。SDS-PAGE和Native-PAGE電泳分析顯示，該纖溶酶含有2個(gè)亞基，分子質(zhì)量分別為31.4 kDa和21.2 kDa。體外實(shí)驗(yàn)顯示，ACase可順次降解人血纖維蛋白原α、β和γ鏈，并且具有明顯的抗凝血作用。因此，該茶樹菇可以作為功能性食品基料用于開發(fā)降低血栓傾向的功能食品。