李璟蓉 思 遠 趙 瑞 吳 江 方銳華

廣州市第一人民醫(yī)院皮膚科，華南理工大學附屬第二醫(yī)院皮膚科 (廣州 510180)

銀屑病是由多種因素作用引起的慢性鱗屑性皮膚病，具有病程遷延不愈和容易反復發(fā)作的特點，嚴重影響病人及其家屬的生活質量[1]。目前，銀屑病的發(fā)病機制尚不明確，但越來越多的研究表明銀屑病屬于免疫介導的多基因遺傳性皮膚病[1]。銀屑病以角質形成細胞過度異常增生為主要特征[2]。研究發(fā)現(xiàn)，可介導免疫調節(jié)的炎癥性因子白介素22(IL- 22)可以誘發(fā)人表皮角質形成細胞的增殖，抑制其凋亡，從而促進銀屑病的發(fā)生和發(fā)展[3- 4]。因此，探尋可以有效抑制IL- 22作用的分子機制將有助于進一步揭示銀屑病的發(fā)病機制，為銀屑病治療靶向藥物的研發(fā)提供新的分子靶點。

microRNAs (miRNAs)是一類長度約為21～23個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[5]。近年來，miRNAs在銀屑病發(fā)生和發(fā)展中的重要作用逐漸被揭示[6]。血清miR- 29a- 3p(也稱為miR- 29a)在自身免疫性疾病如硬皮病和類風濕性關節(jié)炎病人的血清中顯著降低，且miR- 29a- 3p通過抑制STAT3抑制類風濕性關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖和誘導細胞凋亡[7- 8]。鑒于miR- 29a- 3p在自身免疫性疾病中的重要作用，我們推測miR- 29a- 3p可能在調控銀屑病的發(fā)生發(fā)展方面也發(fā)揮重要的作用。因此，本文將研究miR- 29a- 3p對IL- 22誘導的HaCaT細胞增殖及凋亡的影響，初步探討其在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

人永生化表皮細胞HaCaT來自上海中國科學院上海細胞庫；Minimum Essential Medium培養(yǎng)基和胎牛血清產自美國Hyclone；IL- 22產自美國PeproTech；CCK8試劑盒產自日本同仁化學研究所；miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit、SanPrep Column microRNA Extraction Kit和MicroRNAs qPCR Kit (SYBR Green Method)產自上海生工；miR- 29a- 3p mimic合成自上海吉瑪；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit產自美國BD Biosciences；Lipofectamine 2000產自美國invitrogen；細胞周期試劑盒產自上海碧云天。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

HaCaT細胞的培養(yǎng)基為Minimum Essential Medium加10%胎牛血清，置于條件為37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)后，使用不同濃度的IL- 22(0 μg/L，25 μg/L，50 μg/L，100 μg/L)處理細胞24 h和48 h和72 h，CCK8檢測細胞的活力。根據(jù)CCK8結果選擇50 μg/L和100 μg/L的IL- 22的處理HaCaT細胞24 h，收集細胞熒光定量PCR檢測miR- 29a- 3p的表達量。根據(jù)熒光定量PCR的結果，選擇50 μg/L作為后續(xù)實驗IL- 22的處理濃度，按照以下條件處理細胞，進行分組處理：

Cell組：按照轉染的步驟添加Lipofectamine 2000 到HaCaT培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)HaCaT細胞。

IL- 22組：按照轉染的步驟添加Lipofectamine 2000 到HaCaT培養(yǎng)基中，24 h后，使用50 μg/L IL- 22處理HaCaT細胞。

IL- 22+NC組：使用Lipofectamine 2000轉染陰性對照(NC)microRNA mimic，轉染24 h后，使用50 μg/L IL- 22處理HaCaT細胞。

IL- 22+ miR- 29a- 3p組：使用Lipofectamine 2000轉染miR- 29a- 3p mimic，預轉染24 h后，使用50 μg/L IL- 22處理HaCaT細胞。

1.3 細胞增殖實驗

將HaCaT細胞接種在96孔板中，按照以上分組條件處理細胞，分別于IL- 22處理后24、48、72 h，向每孔添加10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)箱內孵育4 h。Varioskan Flash 全波長多功能酶標儀檢測450 nm處的吸光值。按照如下公式計算各組細胞的增值率：增殖率=(實驗組吸光值-對照組吸光值)/對照組吸光值×100%。

1.4 熒光定量PCR

將HaCaT細胞接種在6孔板中，按照以上分組條件處理細胞，于IL- 22處理后24 h，收集細胞。按照SanPrep Column microRNA Extraction Kit的說明書提取miRNAs。按照miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit的說明書進行加尾法的逆轉錄。根據(jù)MicroRNAs qPCR Kit (SYBR Green Method)的說明書配置PCR體系，置于BIO-rad CFX96熒光定量PCR儀上進行PCR擴增反應。miR- 29a- 3p正向引物序列如下：5′-CGGTAGCACCATCTGAAAT-CGGTTA-3′，miR- 29a- 3p反向引物及內參引物由試劑盒提供。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期

將HaCaT細胞接種在12孔板中，按照以上分組條件處理細胞，于IL- 22處理后48 h，收集細胞，按照FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit和細胞周期試劑盒的說明，處理細胞。ACEA NovoCyte流式細胞儀檢測。NovoExpress軟件分析各組細胞的凋亡和周期分步情況。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 IL- 22處理對miR- 29a- 3p表達的影響

見表1，與0 μg/L組相比，25 μg/L組、50 μg/L組和100 μg/L組HaCaT細胞的增殖率在24 h、48 h和72 h均出現(xiàn)升高(F值分別為33.27、36.19、52.29，均P<0.000 1)。

根據(jù)表1的結果，使用0 μg/L、50 μg/L和100 μg/L的IL- 22的處理HaCaT細胞，熒光定量PCR檢測miR- 29a- 3p的表達量，組間miR- 29a- 3p的表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=129，P<0.000 1)。與0 μg/L組相比，miR- 29a- 3p在50 μg/L組和100 μg/L組HaCaT中的表達水平降低(均P=0.000 1)，分別降低83%和80%。因此，選擇50 μg/L作為后續(xù)實驗IL- 22的處理濃度。

表1 IL- 22處理24 h、48 h和72 h對HaCaT細胞增殖率的影響

*與0 μg/L組比較P<0.05。

2.2 過表達miR- 29a- 3p對IL- 22處理的HaCaT細胞增殖的影響

Cell組、IL- 22組、IL- 22+NC組與IL- 22+ miR- 29a- 3p組各組間miR- 29a- 3p的表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=12.31，P=0.002 3)。與IL- 22+NC組相比，IL- 22+ miR- 29a- 3p組miR- 29a- 3p的表達量增加(P=0.002 8)，miR- 29a- 3p在HaCaT細胞中已成功過表達。

Cell組、IL- 22組、IL- 22+NC組與IL- 22+ miR- 29a- 3p組各組間的增殖率在24 h、48 h和72 h差異有統(tǒng)計學意義(24 h：F=31.35，P<0.000 1；48 h：F=44.79，P<0.000 1；72 h：F=14.1，P=0.001 5)。統(tǒng)計結果見表2所示。與Cell組相比，IL- 22組的增殖率在24 h、48 h和72 h 均增高(P值分別為0.000 1、0.000 1、0.002 3)。與IL- 22+NC組相比，IL- 22+miR- 29a- 3p組的增殖率在24 h、48 h和72 h均降低(P值分別為0.002 1、0.001 6、0.023 1)。

表2 過表達miR- 29a- 3p對IL- 22處理的HaCaT細胞增殖的影響

*與Cell組比較P<0.05；#與IL- 22+NC組比較P<0.05。

2.3 過表達miR- 29a- 3p對IL- 22處理的HaCaT細胞凋亡的影響

Cell組、IL- 22組、IL- 22+NC組與IL- 22+ miR- 29a- 3p組各組間HaCaT細胞總凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=275.3，P<0.000 1)。見圖1。與Cell組相比，IL- 22組的細胞總凋亡率降低(11.17±0.75 vs 5.88±0.84，P=0.001 7)。與IL- 22+NC組相比，IL- 22+ miR- 29a- 3p組的細胞總凋亡率增加(6.67±1.06 vs 30.55±1.86，P=0.000 1)。

2.4 過表達miR- 29a- 3p對IL- 22處理的HaCaT細胞周期的影響

Cell組、IL- 22組、IL- 22+NC組與IL- 22+ miR- 29a- 3p組各組間G1期和S期HaCaT細胞比例有差異(G1期：F=166.5，P<0.000 1；S期：F=116.6，P<0.000 1)，各組細胞G2期HaCaT細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(F=1.574，P=0.269 9)。統(tǒng)計結果見表3，代表圖見圖2。與Cell組相比，IL- 22組G1期HaCaT細胞比例降低(P=0.000 1)，S期HaCaT細胞比例升高(P=0.000 1)。與IL- 22+NC組相比，IL- 22+ miR- 29a- 3p組G1期HaCaT細胞比例增加(P=0.000 1)，S期HaCaT細胞比例降低(P=0.000 1)。

圖1

表3 過表達miR- 29a- 3p對IL- 22處理的HaCaT細胞周期的影響

*與Cell組比較P<0.05；#與IL- 22+NC組比較P<0.05。

圖2 各組細胞周期代表圖

3 討 論

銀屑病是成人最常見的皮膚病，全世界1%～3%的人口受其影響。銀屑病最常見的類型是尋常型銀屑病，臨床表現(xiàn)為紅斑。銀屑病的主要特點之一是角質形成細胞的異常增殖和分化異常[2]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞免疫尤其是T細胞激活及后繼的細胞因子釋放在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色[9]。IL- 22是由Thl7和Th22等不同來源的T細胞產生的細胞炎性因子。研究發(fā)現(xiàn)，IL- 22參與抑制角質形成細胞的分化和異常增生，誘導銀屑病樣表皮改變[3- 4]。因此，阻斷IL- 22的作用將有可能改善銀屑病樣表皮改變，從而遏制銀屑病的發(fā)生發(fā)展。

近年來，表觀遺傳學因其在銀屑病發(fā)病機制中的參與而受到關注，miRNA在銀屑病中的作用逐漸被重視[6]。miRNAs可能在銀屑病的角質形成細胞的增生、分化和免疫激活異常中發(fā)揮重要作用。本文，我們構建了IL- 22誘導HaCaT細胞異常增生模型，并分析了miR- 29a- 3p在調節(jié)IL- 22誘導的HaCaT細胞異常增生中作用，初步評價結miR- 29a- 3p在銀屑病中的作用。本文是首次報道m(xù)iR- 29a- 3p參與調節(jié)IL- 22誘導的角質形成細胞異常增生。

我們研究發(fā)現(xiàn)，IL- 22處理可以促進HaCaT細胞增殖，而過表達miR- 29a- 3p則可以抑制IL- 22對HaCaT細胞的影響。另外，我們發(fā)現(xiàn)過表達miR- 29a- 3p可以增加G1期HaCaT細胞的比例，同時減少S期細胞的比例，提示過表達miR- 29a- 3p可以引起HaCaT細胞G1期阻滯，進而抑制細胞增殖。另外，過表達miR- 29a- 3p可以促進IL- 22處理下HaCaT細胞的凋亡。我們的結果說明，miR- 29a- 3p可以抑制IL- 22誘發(fā)的角質形成細胞的異常增生。

miRNAs靶基因的鑒定對闡明miRNAs的功能十分重要。通過文獻查閱，我們發(fā)現(xiàn)miR- 29a- 3p的靶基因之一是信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)[7]。STAT3是一種重要的轉錄因子，其通過參與Th17細胞分化、角質形成細胞過度增生與異常分化、與炎癥細胞相互作用、真皮血管增生等重要病理過程在自身免疫性疾病如銀屑病發(fā)病中起關鍵作用[10- 11]。IL- 22作用于角質形成細胞后使細胞中STAT3表達升高[12]。miRNAs可以與靶向基因3′非編碼區(qū)的互補序列結合，從而抑制靶mRNA翻譯成蛋白質或者加速其降解[5]。因此，我們推測miR- 29a- 3p通過降低IL- 22誘導的STAT3高表達而發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑制STAT3可以誘發(fā)細胞周期的G1期阻滯，并促進細胞凋亡[13- 14]，這和miR- 29a- 3p過表達的作用一致。這也可以佐證我們的推測，即miR- 29a- 3p通過降低IL- 22誘導的STAT3高表達而發(fā)揮作用。

總之，我們發(fā)現(xiàn)IL- 22可以降低HaCaT細胞中miR- 29a- 3p的表達水平。IL- 22可以誘導HaCaT細胞過度增殖和細胞凋亡的抑制，而過表達miR- 29a- 3p則可以抑制IL- 22對HaCaT細胞的影響?；趍iR- 29a- 3p對IL- 22誘導的HaCaT細胞的影響，我們推測miR- 29a- 3p可能在銀屑病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能成為新的治療靶點。