向曉輝， 毛 駿， 李 海

1 天津市西青醫(yī)院 消化內(nèi)科， 天津 300380； 2 天津市肝臟胰腺纖維化與分子診療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300162；3.武警后勤學(xué)院， 天津 300309

肝細(xì)胞癌作為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，多數(shù)患者早期可無(wú)任何癥狀，少數(shù)可出現(xiàn)腹痛、發(fā)燒、嗜睡等癥狀，臨床表現(xiàn)集中發(fā)生在疾病的晚期[1-2]。全球僅2018年統(tǒng)計(jì)新發(fā)病例達(dá)84.1萬(wàn)例，死亡78.2萬(wàn)例，且易患人群呈年輕化趨勢(shì)[3]。目前臨床上肝細(xì)胞癌患者的遠(yuǎn)期生存率不甚理想，其高病死率很大程度上與腫瘤確診時(shí)間晚、轉(zhuǎn)移發(fā)生早相關(guān)[4-5]。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain-containing protein，CCDC)蛋白家族是一種由兩個(gè)或兩個(gè)以上的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域組成的同寡聚體或寡聚體序列蛋白，可通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期等多種途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[6]。近年來(lái)越來(lái)越多研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，CCDC蛋白在甲狀腺癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。蛋白家族成員CCDC34又稱為腎臟癌抗原NY-REN-41，由373個(gè)氨基酸組成，位于11p14.1染色體[11]。目前，CCDC34基因與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性研究尚不深入，本研究擬基于癌癥基因組圖集(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)探討CCDC34基因在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義，以期為肝細(xì)胞癌提供新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 自 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cancergenome.nih.gov/)下載了374例肝細(xì)胞癌組織樣本和50例癌旁組織樣本的mRNA表達(dá)譜及臨床數(shù)據(jù)，其中370例患者具有匹配的mRNA表達(dá)譜和生存數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)處理與患者分組 下載edge R軟件包(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/e

dgeR.html),對(duì)mRNA原始數(shù)據(jù)進(jìn)行基于加權(quán)截尾均值化M值標(biāo)準(zhǔn)化處理，并經(jīng)log2轉(zhuǎn)換后用于后續(xù)分析[12-13]?；诟渭?xì)胞癌患者CCDC34基因表達(dá)譜和隨訪數(shù)據(jù)，根據(jù)X-tile 3.6.1軟件 (Yale University School of Medicine，New Haven，CT，USA)確立最佳分組截?cái)嘀怠Ｈ∽罴呀財(cái)嘀?.30將其分為高表達(dá)組(90例)和低表達(dá)組(280例)。

1.3 基因集富集分析 使用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)軟件研究CCDC34基因表達(dá)水平與京都基因和基因組百科全書通路基因集的相關(guān)性[14-16]。根據(jù)CCDC34基因的表達(dá)水平建立連續(xù)表型，按默認(rèn)加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)(default weighted enrichment statistic)的方法計(jì)算CCDC34基因與參照基因集的Pearson相關(guān)系數(shù)，并按照相關(guān)系數(shù)大小進(jìn)行基因排序。設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1000次，計(jì)算富集系數(shù)(enrichment score，ES)和標(biāo)準(zhǔn)化后的富集系數(shù)(normallized enrichment score，NES)，以標(biāo)準(zhǔn)化P<0.01且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates，F(xiàn)DR)<0.05為顯著性富集。

2 結(jié)果

2.1 CCDC34基因在癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá) 在TCGA庫(kù)中，CCDC34基因在患者癌組織和癌旁組織的表達(dá)水平分別為8.732±0.987和7.236±0.647，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-14.261，P<0.001)；在同一患者的癌組織和癌旁組織的表達(dá)水平分別為8.853±1.008和7.236±0.647，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-11.194，P<0.001)(圖1)。

注：a，TCGA庫(kù)肝細(xì)胞癌患者癌組織和癌旁組織中CCDC34基因的差異表達(dá)；b，同一患者癌組織和癌旁組織中CCDC34基因的差異表達(dá)。

圖1CCDC34基因在患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 腫瘤組織中CCDC34基因表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 對(duì)TCGA庫(kù)中數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)列表分析，CCDC34基因的表達(dá)水平在TNM分期和腫瘤分級(jí)之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而在患者年齡、性別、有無(wú)肝纖維化和有無(wú)血管浸潤(rùn)等指標(biāo)之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

2.3 CCDC34基因與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)性 CCDC34基因高表達(dá)患者總生存期顯著低于低表達(dá)患者(χ2=21.716，P<0.001)，提示CCDC34基因高表達(dá)在肝細(xì)胞癌中是一項(xiàng)預(yù)后不良的因素(圖2)。單因素Cox回歸分析提示，CCDC34基因表達(dá)水平和TNM分期與肝細(xì)胞癌患者總生存期有關(guān)(P值均<0.001)。多因素Cox回歸分析進(jìn)一步提示，上述兩項(xiàng)指標(biāo)是影響肝細(xì)胞癌患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P值均<0.05)(表2)。

表1 CCDC34基因表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

風(fēng)險(xiǎn)人數(shù)

高表達(dá)n=90n=20n=7n=0n=0

低表達(dá)n=280n=89n=35n=9n=1

圖2CCDC34基因表達(dá)水平和肝細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

2.4 CCDC34基因功能富集分析 在TCGA庫(kù)中的數(shù)據(jù)分析顯示，CCDC34基因高表達(dá)樣本富集到堿基切除修復(fù)、剪接體、核苷酸切除修復(fù)、嘧啶代謝、DNA復(fù)制、同源重組、細(xì)胞周期、錯(cuò)配修復(fù)等8個(gè)相關(guān)通路基因集(P<0.01，F(xiàn)DR<0.05)，提示CCDC34基因可能通過(guò)上述通路發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用(表3，圖3)。

表3 CCDC34基因正相關(guān)的肝細(xì)胞癌樣本富集的通路基因集

3 討論

近年來(lái)越來(lái)越多的研究開始關(guān)注CCDC蛋白家族在腫瘤中的作用，研究報(bào)道CCDC蛋白的表達(dá)異?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與遷移[17-18]。CCDC34蛋白作為CCDC蛋白家族中的一員，其在腫瘤中的潛在臨床價(jià)值也被日益重視。Geng等[19]報(bào)道CCDC34蛋白可能通過(guò)抑制癌細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)侵襲來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。另有研究[20]證實(shí)，CCDC34蛋白在食管鱗癌中過(guò)表達(dá)，其與腫瘤進(jìn)展、血管生成和不良的存活率有關(guān)，并且可用作指示患者預(yù)后不良的獨(dú)立參數(shù)。探討CCDC34基因與肝細(xì)胞癌預(yù)后的相關(guān)性及其臨床價(jià)值無(wú)疑將有利于肝細(xì)胞癌的個(gè)體化診斷，從而為臨床提供潛在的新治療靶點(diǎn)。

本研究著重探討CCDC34基因與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性及其臨床價(jià)值，借助TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)CCDC34基因 mRNA表達(dá)譜證實(shí)，CCDC34基因在肝細(xì)胞癌組織中mRNA表達(dá)水平較癌旁肝組織呈現(xiàn)上調(diào)，表明CCDC34基因具備作為肝細(xì)胞癌病理診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值。結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝細(xì)胞癌患者的臨床數(shù)據(jù)，本研究進(jìn)一步分析了CCDC34基因表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CCDC34基因表達(dá)水平與TNM分期和腫瘤分級(jí)相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，CCDC34基因高表達(dá)患者總生存期顯著低于低表達(dá)患者，多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，CCDC34基因表達(dá)水平是影響肝細(xì)胞癌患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示該基因有望成為肝細(xì)胞癌腫瘤診斷和患者預(yù)后判斷的新型分子標(biāo)志物。借助基因集富集分析，本研究發(fā)現(xiàn)CCDC34基因高表達(dá)組顯著富集于堿基切除修復(fù)、剪接體等8條信號(hào)通路。細(xì)胞增殖能力是評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞惡性程度的重要指標(biāo)之一，腫瘤細(xì)胞通過(guò)周期性的有絲分裂不斷增殖。在細(xì)胞周期的間期，細(xì)胞核苷酸嘧啶代謝增強(qiáng)，合成DNA復(fù)制所需的各種前體物和酶分子，從而完成DNA復(fù)制[21]。Gong等[22]發(fā)現(xiàn)CCDC34蛋白在膀胱癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的siRNA抑制其表達(dá)可以顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G2/M期并增加體外細(xì)胞的凋亡。結(jié)合GSEA結(jié)果，筆者推測(cè)CCDC34基因可能通過(guò)促進(jìn)嘧啶代謝、DNA復(fù)制等方式調(diào)控細(xì)胞周期，增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖能力。當(dāng)前，放療和化療仍是治療肝癌的主要手段，其本質(zhì)是通過(guò)造成DNA損傷以誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)途徑主要包括錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、跨損傷合成和同源重組等，其修復(fù)能力越強(qiáng)，放療化療抵抗往往越強(qiáng)。CCDC34基因可能通過(guò)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)等能力，提高肝癌細(xì)胞對(duì)放化療損傷的耐受性[23-25]。通過(guò)對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，剪接體突變可以通過(guò)干擾姐妹染色單體的聚集，影響染色體穩(wěn)定性、DNA修復(fù)和基因調(diào)節(jié)而最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[26]。雖然本研究為深入探討CCDC34基因在肝細(xì)胞癌中的作用提供了線索和依據(jù)，但是腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)由多基因協(xié)同進(jìn)行的復(fù)雜調(diào)控過(guò)程，CCDC34基因通過(guò)上述通路參與肝細(xì)胞癌發(fā)展的具體機(jī)制仍有待后續(xù)研究予以進(jìn)一步闡明。

表2 影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析

注：a，富集堿基切除修復(fù)通路基因集；b，富集剪接體通路基因集；c，富集核苷酸切除修復(fù)通路基因集；d，富集嘧啶代謝通路基因集；e，富集DNA復(fù)制通路基因集；f，富集同源重組通路基因集；g，富集細(xì)胞周期通路基因集；h，富集錯(cuò)配修復(fù)通路基因集。

綜上所述，本研究通過(guò)運(yùn)用相關(guān)生物信息學(xué)方法揭示了CCDC34基因作為促癌基因參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，有助于改善肝細(xì)胞癌患者治療后復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)策略，從而為臨床上早診斷早治療提供了新的思路。