張 杰，趙 昂，鮑曉文，張銘雅，馬 博

(南京工業(yè)大學 藥學院，江蘇 南京 211800)

雷公藤甲素被認為是雷公藤的主要活性成分，生物活性廣泛，具有抗炎、免疫抑制、抗囊腫和抗腫瘤等作用[1]。但是，雷公藤甲素對機體的毒性嚴重限制了其臨床應用，例如可能會導致男性不育、白血球減少癥、月經(jīng)紊亂，易導致腎毒性和肝毒性[2-3]。其中，雷公藤甲素所造成的生殖功能障礙是最為高發(fā)的毒性反應之一。因此，雷公藤甲素常被用來作為模型藥物誘發(fā)雄性動物的不育模型，其潛在機制可能是雷公藤甲素所導致的睪丸內(nèi)抗氧化系統(tǒng)損傷，從而造成氧化與抗氧化失衡，使睪丸內(nèi)部產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，繼而引起睪丸細胞凋亡[4-5]。

紫云英苷又名黃芪苷、百蕊草素II，山奈酚-3-O-葡萄糖苷，廣泛存在于菟絲子、百蕊草和杜仲等植物中，是主要的活性成分之一，研究表明：紫云英苷具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗氧化及調(diào)節(jié)機體免疫力等[6-7]。紫云英苷具有緩解遠志皂苷引起的溶血作用和抗CCl4肝毒的作用，同時可以提高小鼠體內(nèi)超氧歧化酶(SOD)活性，降低小鼠肝內(nèi)氧化應激標志物丙二醛(MDA)的含量以及增加機體抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的含量[8]。

中藥菟絲子和杜仲被長期用于治療男性生殖系統(tǒng)疾病,紫云英苷作為其中的主要活性成分卻鮮有相關的報道。因此，本研究采用雷公藤甲素導致小鼠睪丸睪丸損傷模型，研究被雷公藤甲素損傷后，紫云英苷對睪丸指數(shù)、睪丸組織學、氧化應激水平的改善，以評價其對小鼠睪丸睪丸損傷的治療作用。并通過原位末端缺刻標記法(TUNEL)法研究睪丸內(nèi)細胞凋亡情況及免疫印跡法(Western blotting法)和免疫組化技術檢測磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)的表達，以探討紫云英苷改善雷公藤甲素導致的睪丸損傷的作用機制，以期為進一步開發(fā)成為治療男性生殖系統(tǒng)疾病的藥物提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

雷公藤甲素(純度≥98%)、紫云英苷(純度≥98%)，上海源葉生物公司；免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；SOD測定試劑盒、MDA測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，上海碧云天生物技術公司；一抗p-JNK、β-actin以及二抗，美國丹弗斯Cell Signaling Technology (CST)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模與分組

昆明種雄性小鼠60只,體質量(25±2)g,將小鼠隨機分成3組,每組20只,即正常對照組、雷公藤甲素模型組和紫云英苷組。

各組的具體給藥方式如下(給藥標準按每10 g小鼠體質量計。)。正常對照組：口服灌胃生理鹽水(0.1 mL)，0.5 h后腹腔注射生理鹽水(0.1 mL)；模型組：口服灌胃生理鹽水(0.1 mL)，0.5 h后腹腔注射雷公藤甲素(80 μg/kg，給藥體積為0.1 mL)；紫云英苷組：口服灌胃紫云英苷(15、30和60 mg/kg，給藥體積為0.1 mL)，0.5 h后腹腔注射雷公藤甲素(80 μg/kg，給藥體積為0.1 mL)。按以上方法給藥14 d。

1.2.2 睪丸指數(shù)

小鼠處死后，立即取出雙側附睪及雙側睪丸，剝離連黏的脂肪組織，迅速稱質量并記錄濕質量，按式(1)計算睪丸指數(shù)。

睪丸指數(shù)=睪丸質量(g)/體質量(g)

(1)

1.2.3 睪丸組織的形態(tài)學觀察

取睪丸放入質量分數(shù)為10%甲醛固定液中，沿其長軸垂直于生精小管走向剖開，經(jīng)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色，置光鏡下觀察。

1.2.4 睪丸組織SOD活性和MDA含量的測定

取小鼠睪丸低溫勻漿后離心取上清，根據(jù)1.1項中的試劑盒說明書分別測定SOD活性和MDA含量。取等量小鼠睪丸低溫勻漿后提取總蛋白，并用二辛可寧酸(BCA)法進行蛋白濃度測定。利用睪丸的蛋白濃度對相對應的睪丸內(nèi)的SOD活性與MDA含量進行校正。

1.2.5 睪丸TUNEL染色

小鼠睪丸石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加20 μL不含DNase的蛋白酶K室溫孵育30 min，后加入體積分數(shù)3% H2O2溶液孵育10 min以滅活內(nèi)源性酶，隨后滴加50 μL TUNEL 反應混合液，37 ℃孵育60 min。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，脫水、透明后用含抗淬滅劑的封片劑封片，再在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 睪丸免疫組織化學檢測睪丸組織中JNK(p-JNK)的表達

切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液微波修復10 min; 滴加p-JNK一抗，4 ℃過夜，PBS 緩沖液漂洗2 min,3 次后加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 緩沖液漂洗2 min，3次后滴加鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex,SABC),37 ℃ 孵育20 min。隨后使用氧化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色并用蘇木素輕度復染，最后以中性樹膠封片。置于光學顯微鏡下觀察拍照后用Image pro plus 軟件進行圖像分析。

1.2.7 Western blotting法測定p-JNK在睪丸組織中的蛋白表達

取一定量的睪丸組織，PBS 液清洗3 次，加入蛋白裂解液后勻漿，冰上孵育30 min；4 ℃離心10 min，12 000 r/min 高速離心；吸取上清液即為蛋白液。利用甲酸(BCA)法測定提取蛋白的濃度，制備蛋白樣品。恒壓模式下行SDS-PAGE 凝膠電泳，恒流濕式電轉移法進行轉膜；質量分數(shù)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育兔抗p-JNK抗體和內(nèi)參β-actin抗體，4 ℃過夜。滴加辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗，在 ChemiDocTM XRS+成像系統(tǒng)中采用增強型化學發(fā)光法(ECL法)進行化學發(fā)光檢測,并用 Image LabTM software 對條帶進行光密度定性分析。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

各實驗組數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD) 表示，采用系統(tǒng)統(tǒng)計軟件SPSS 17.0 進行方差齊性檢驗，方差齊后的各組采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較用最小顯著性差異法(least-significant difference,LSD)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 紫云英苷對睪丸指數(shù)的影響

取各組小鼠雙側睪丸并稱質量，考察紫云英苷對雷公藤甲素損傷的小鼠睪丸的質量的影響，結果見圖1。由圖1可知：雷公藤甲素模型組睪丸指數(shù)相對于正常組有顯著下降(P<0.01)，說明在雷公藤甲素的毒性作用下，小鼠睪丸發(fā)生了明顯的病變性萎縮；低劑量(15 mg/kg)紫云英苷即展現(xiàn)出明顯的抗雷公藤甲素對睪丸的毒性作用，其顯著增加了小鼠睪丸的質量，提高了小鼠睪丸指數(shù)(P<0.05)；中高劑量(20 mg/kg)紫云英苷對睪丸的保護作用更加顯著，小鼠睪丸質量指數(shù)極顯著改善(P<0.05)，并趨近于正常，且保護作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖1 紫云英苷對雷公藤甲素誘導的小鼠睪丸指數(shù)的影響Fig.1 Effects of astragalin on triptolide-induced mice testis index

2.2 紫云英苷對睪丸組織形態(tài)學的影響

通過小鼠睪丸HE染色病理分析，考察紫云英苷對雷公藤甲素造成的小鼠睪丸損傷的影響，結果見圖2。由圖2(a)可知，正常對照組小鼠睪丸生精上皮厚，細胞層次寬，曲細精管內(nèi)各級生精細胞排列規(guī)則，基底面至腔面可見精原細胞、初級精母細胞、精子細胞等各個發(fā)育階段細胞，腔內(nèi)可見成熟精子，間質細胞發(fā)育良好。由圖2(b)可知，在雷公藤甲素的毒性作用下，模型組曲細精管萎縮變形或扭曲成不規(guī)則形狀，生精細胞數(shù)量及管腔內(nèi)精子細胞數(shù)量明顯少于正常對照組。模型組睪丸組織形態(tài)學的顯著病變充分說明了雷公藤甲素對雄性動物的生殖毒性。由圖2(c)可知，在低劑量紫云英苷保護作用下，小鼠曲細精管有不同程度的萎縮變形，生精細胞數(shù)量及管腔內(nèi)精子細胞數(shù)量明顯少于正常對照組，但多于模型組。說明低劑量紫云英苷抗雷公藤甲素生殖毒性的作用已有所體現(xiàn)。由圖2(d)可知，中劑量紫云英苷保護組小鼠睪丸曲細精管的變形程度與模型組相比已有明顯改善，部分管腔內(nèi)可見絲狀精子細胞各級生精細胞排列規(guī)則。說明中劑量紫云英苷已可以保護小鼠睪丸的組織形態(tài)，并逐漸恢復雷公藤甲素造成的小鼠生精功能障礙。由圖2(e)可知，高劑量紫云英苷治療組小鼠的睪丸曲細精管較為完整，生精細胞排列有序，層次清楚，間質趨近于正常，精細胞及管腔內(nèi)精子細胞數(shù)量基本正常。說明高劑量的紫云英苷展現(xiàn)出良好的逆轉雷公藤甲素所造成的生殖毒性作用，使小鼠的睪丸趨近于正常狀態(tài)，并已恢復其生理功能。

圖2 睪丸組織形態(tài)學觀察紫云英苷對雷公藤甲素導致的睪丸組織形態(tài)損傷的保護Fig.2 Protection of astragalin against triptolide-induced damage of testicular tissue morphology

2.3 紫云英苷對睪丸氧化應激水平的影響

睪丸是產(chǎn)生精子和分泌睪酮的重要器官，其富含線粒體及黃嘌呤氧化酶等生成活性氧自由基的酶類，且具有多量不飽和脂肪酸，使睪丸組織對于氧化應激損傷更加敏感[9]。因此，抑制雷公藤甲素對睪丸的氧化應激損傷成為了減弱雷公藤甲素雄性生殖毒性的重要策略之一。

圖3 紫云英苷對雷公藤甲素誘導的MDA 和SOD活性的影響Fig.3 Effects of astragalin on of the level MDA and the activity superoxide dismutase SOD induced by triptolide in mice testis

MDA是膜脂質過氧化最重要的標志產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷。因此可通過MDA了解膜脂過氧化的水平，反映機體組織內(nèi)脂質過氧化的程度，并間接反映細胞氧化損傷的程度。SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，能夠歧化O2-形成H2O2，消除超氧陰離子毒性。因此，筆者通過檢測睪丸內(nèi)MDA含量及SOD活性，考察紫云英苷對雷公藤甲素造成的睪丸內(nèi)氧化應激的影響，結果見圖3。由圖3可知：與正常對照組相比，雷公藤甲素模型組睪丸內(nèi)的SOD活性明顯降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)，睪丸內(nèi)的過氧化環(huán)境可能成為小鼠睪丸受損的原因之一。而不同劑量的紫云英苷保護組小鼠睪丸內(nèi)SOD活性較模型組明顯升高(P<0.05)，MDA含量顯著下降(P<0.05)。隨著紫云英苷劑量的提高，小鼠睪丸內(nèi)的過氧化狀態(tài)不斷趨于正常的平衡態(tài)，即SOD活性的提高和MDA含量的下降與紫云英苷劑量之間呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性關系。說明紫云英苷良好的抗氧化作用可以對抗雷公藤甲素造成的睪丸內(nèi)過氧化，恢復小鼠睪丸內(nèi)氧化-抗氧化平衡。

2.4 紫云英苷對睪丸細胞凋亡的影響

當機體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生超過抗氧化能力，組織脂質過氧化水平升高，將引起蛋白質表達異常，進一步誘發(fā)細胞凋亡[10]。通過TUNEL染色法，考察紫云英苷對雷公藤甲素造成的睪丸內(nèi)細胞凋亡的影響，結果見圖4。由圖4可知，TUNEL染色結果中，正常對照組中只可見極少的睪丸間質細胞與支持細胞發(fā)生凋亡，雷公藤甲素模型組的凋亡率顯著高于正常對照組。紫云英苷對雷公藤甲素造成的睪丸內(nèi)生殖細胞的凋亡則有明顯的抑制作用，且抑制作用具有劑量依賴性。

2.5 紫云英苷對睪丸p-JNK表達的影響

Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)：雷公藤甲素在體內(nèi)外均可破壞睪丸支持細胞內(nèi)的氧化還原平衡，促使活性氧簇(ROS)水平提高，從而激活JNK通路導致細胞凋亡。通過免疫組化考察紫云英苷對雷公藤甲素誘導的睪丸內(nèi)p-JNK表達的影響，結果見圖5。其中p-JNK免疫組化染色著色于細胞質和細胞膜，免疫組化陽性細胞胞質和胞膜可見棕黃色顆粒，細胞無色或淡黃色為陰性。由圖5可知：與正常對照組相比，雷公藤甲素使模型組小鼠睪丸內(nèi)p-JNK表達量顯著上升(P<0.01)；經(jīng)低劑量紫云英苷治療后，小鼠睪丸內(nèi)棕黃色顆粒相較于模型組顯著減少，即p-JNK表達量顯著降低(P<0.01)；中劑量紫云英苷治療后，小鼠睪丸內(nèi)p-JNK表達量顯著低于模型組(P<0.01)，且和低劑量組相比也有較大下降；高劑量紫云英苷的保護作用明顯逆轉了雷公藤甲素對睪丸內(nèi)p-JNK的上調(diào)作用，p-JNK的陽性表達同樣顯著低于模型組(P<0.01)，使小鼠睪丸組織內(nèi)p-JNK的表達量趨于正常。

圖4 紫云英苷對雷公藤甲素誘導的睪丸細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of astragalin on triptolide-induced apoptosis in testicular cells

圖5 免疫組化法紫云英苷對雷公藤誘導的睪丸p-JNK表達的影響Fig.5 The protein expression of p-JNK in triptolide-induced mice testis detected by immunohistochemistry

同時，結合Western blotting法考察紫云英苷對雷公藤甲素誘導的睪丸內(nèi)p-JNK蛋白表達量的影響，結果見圖6。由圖6可知，相較于正常組，模型組中雷公藤甲素可使活化的p-JNK蛋白表達量大量提高(P<0.01)。紫云英苷的治療作用體現(xiàn)在其可以抑制p-JNK的表達，即在低劑量的情況下，小鼠睪丸p-JNK表達量便與模型組形成顯著性差異(P<0.05)；并隨著給藥劑量的上升，中、高劑量組小鼠睪丸的p-JNK表達與模型組相比形成極顯著性差異(P<0.01)。其結果與免疫組化結果一致，提示紫云英苷對雷公藤甲素造成的睪丸細胞損傷的保護作用可能與其抑制p-JNK的表達有關。

圖6 免疫印跡法檢測紫云英苷對雷公藤甲素誘導的 睪丸p-JNK表達的影響Fig.6 The protein expression of p-JNK in triptolide-induced mice testis detected by Western blotting

3 結論

本研究中，紫云英苷可以有效地逆轉雷公藤甲素造成的小鼠睪丸指數(shù)下降，修復睪丸組織形態(tài)的損傷，對小鼠睪丸結構和功能起到了良好的保護作用。其保護作用的具體機制可能與紫云英苷可以抑制雷公藤甲素引起的小鼠睪丸內(nèi)的氧化還原失衡，進而抑制p-JNK的表達，從而減少睪丸細胞凋亡有關。

綜上所述，本研究為探討紫云英苷作為睪丸氧化應激損傷潛在的預防和治療藥物奠定了實驗基礎。