孫琳珺，胡麗麗，田世紅，王 翔，劉 弘，羅寶章，宋 夏，楊京津，董慶利

(1.上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093；2.上海市疾病預防控制中心，上海 200336)

近年來，全球食源性疾病頻發(fā)，受到公眾的廣泛關注。2018年，歐盟報道了91 662起由沙門氏菌引起的病例，其中西班牙報道了9 526起[1]。原國家衛(wèi)生計生委辦公廳2015年發(fā)布數(shù)據(jù)，表明全國由致病微生物導致的食物中毒事件顯著高于其他危害，發(fā)病率占總數(shù)的53.7%(3 181/5 926)，其中沙門氏菌是引起食源性疾病的主要致病菌之一[2]，廣泛存在于自然界中，尤其存在于畜禽肉與蛋類等食品中[3]。當大量攝入(105～106個/g)時將會引起傷寒和副傷寒、急性腸胃炎等疾病，具有相當高的風險[4]，近年來在陜西省漢中市[5]和四川省成都市[6]的監(jiān)測中都有沙門氏菌的高檢出率。

微生物風險評估(microbial risk assessment,MRA)可從科學角度有效控制食品生產(chǎn)加工過程中可能的微生物危害，降低食品安全風險[7]。微生物半定量風險評估(semi-quantitative microbial risk assessment)是使用評分或賦值的方式或者借助半定量風險評估軟件對風險發(fā)生的可能性及嚴重程度進行計算和描述[8]，如澳大利亞的Risk ranger軟件[9-10]、荷蘭Evers等[11]開發(fā)的快速定量風險評估工具(swift quantitative microbiological risk assessment,sQMRA)。sQMRA工具通過分析從零售階段開始致病菌轉移的關鍵環(huán)節(jié)，設置包括交叉污染等11個參數(shù)，從而推測特定食品-致病菌組合的發(fā)病率和感染人數(shù)。朱江輝等[12]運用sQMRA工具對2008年9—11月牡蠣中副溶血性弧菌的11個參數(shù)進行推演。交叉污染作為引起食源性疾病爆發(fā)的重要因素之一，其參數(shù)設置至關重要，包括交叉污染比例(Scc/r)交叉污染菌量減少比例(Fcc)以及交叉污染菌量攝入比例(Fei)3個交叉污染參數(shù)有待深入探討。

基于此，本文中，筆者以腸炎沙門氏菌風險評估中2 組典型的食源性致病菌-食品組合(腸炎沙門氏菌-雞蛋，腸炎沙門氏菌-牛肉)的交叉污染參數(shù)為切入點，通過消費習慣法調研和實證研究2種方式對sQMRA工具中的3個交叉污染參數(shù)進一步明確，為更好運行工具開展半定量風險評估提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸炎沙門氏菌(ATCC13076)，ATCC；雞蛋、棉簽、牛肉、案板、刀具，上海卜蜂蓮花超市，樣品均放于4 ℃冷藏冰箱中備用；胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基(BPW)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(HE)、無菌均質袋、手套，青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-S 75SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；電磁爐，上海慧儀儀器廠；XW-80A 型漩渦混合器，上海精科實業(yè)有限公司；Scientz-09型無菌均質器，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；SW-CJ-IC型超凈工作臺、SPX-250B-II 型生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；100～1 000 μL、20～100 μL 移液槍，艾本德公司；JT302N 型電子天平，上海精天電子儀器有限公司。

1.3 菌種制備、介質及樣品滅菌

取保藏于-80 ℃的甘油保藏管[13]中的腸炎沙門氏菌移至BPW培養(yǎng)基中進行活化，隨后于TSA培養(yǎng)基上進行劃線，將已劃線平板置于(4±0.5) ℃冰箱中臨時保存。使用時在已劃線平板上挑取單菌落，接種于BPW培養(yǎng)基中，于 37 ℃、140 r/min搖床中培養(yǎng)16～18 h至穩(wěn)定期，經(jīng)生理鹽水稀釋得到108CFU/mL 的初始菌懸液備用。

試驗中對案板、刀具、手套等進行相應滅菌方式見表1。其中雞蛋和牛肉在滅菌后置于(4±0.5)℃冰箱中儲藏備用。

表1 交叉污染試驗中各介質的滅菌方式

1.4 兩組食源性致病菌-食品組合的Scc/r參數(shù)調研

確定腸炎沙門氏菌-雞蛋，腸炎沙門氏菌-牛肉2組Scc/r參數(shù)，通過專家啟發(fā)法獲取交叉污染發(fā)生比例[14]并結合上海市消費者習慣調研廚房階段不同食物烹飪方式占比。其中，腸炎沙門氏菌-雞蛋組合中的烹飪方式包括煮、炒、生食、蒸、烙、熟食、烤、生吃、其他；腸炎沙門氏菌-牛肉中的烹飪方式包括煮、炒、炸、蒸、烙、熟食、烤、其他。

1.5 腸炎沙門氏菌-雞蛋的Fcc和Fei參數(shù)確定

為確定腸炎沙門氏菌-雞蛋的Fcc和Fei參數(shù)，試驗研究蛋殼及蛋液中腸炎沙門氏菌到手套上的轉移以及研究手套中腸炎沙門氏菌到熟雞蛋上的轉移。

試驗根據(jù)實際情況，將蛋殼以及蛋液分為以下兩部分試驗。

1)將蛋殼樣品(2 cm×2 cm)浸泡于載有1 mL初始菌懸液的培養(yǎng)皿中30 s。采用擦拭取樣法測定其中一份樣品表面帶菌量，確定初始接菌量。另一份樣品蛋殼置于手套上(2 cm×2 cm)接觸15 min，使用無菌鉗翻動蛋殼樣品，使菌液均勻黏附于手套表面。15 min后移除蛋殼，采用擦拭取樣法測定手套表面帶菌量[15],計算Fcc參數(shù)值。試驗重復3次。

2)取蛋液樣品24 mL于無菌均質袋中，向均質袋中加入1 mL初始菌懸液，并進行均質。將手套表面(2 cm×2 cm)放入蛋液中，靜置15 min，使菌液充分黏附在手套上。靜置后取出手套，通過擦拭取樣法測定手套表面帶菌量[15]，計算Fcc參數(shù)值。試驗重復3次。

取出已滅菌手套(2 cm×2 cm)于無菌操作臺中，接種1 mL初始菌懸液于手套，靜置15 min。靜置后對手套進行3種不同清潔方式處理(S1：不清洗、S2：500 mL無菌水清洗瀝干、S3：500 mL洗潔精水清洗瀝干)。將手套覆蓋于去殼熟雞蛋表面(2 cm×2 cm)靜置15 min。靜置后取出手套，通過擦拭取樣法測定熟雞蛋表面帶菌量[16]，計算Fei參數(shù)值。試驗重復3次。

1.6 腸炎沙門氏菌-牛肉的Fcc和Fei參數(shù)確定

針對于腸炎沙門氏菌-牛肉的Fcc和Fei參數(shù)確定，測定生牛肉中腸炎沙門氏菌到3種廚房器具(刀具、案板、手套)的轉移以及單一介質和組合介質(圖1)中腸炎沙門氏菌到牛肉的轉移。

*假設在一種介質轉移到另一種介質當中時，帶菌牛肉轉移到介質上的菌量與介質轉移至牛肉的菌量相同圖1 7種場景下不同介質組合方式Fig.1 Combination mode of different media under seven scenarios

稱取 25 g無菌牛肉樣品放置于均質袋中，移液1 mL初始菌懸液與樣品表面，靜置15 min，確保菌液均勻黏附在其表面。取出樣品加入225 mL生理鹽水后均質，測定其初始接菌量。其余樣品分別放置于3種介質(刀具、案板、手套，5 cm×5 cm)上，使用無菌鉗翻動數(shù)次，使菌液重復黏附在介質上，靜置15 min[15]。通過擦拭取樣法測定介質表面菌量，計算Fcc參數(shù)值。試驗重復3次。

在3種不同的介質(刀具、案板、手套，5 cm×5 cm)上接種1 mL初始接菌液，靜置15 min，將25 g無菌熟牛肉樣品分別接觸單個介質或者多個介質。測定接觸后熟牛肉菌量[15]，計算Fei參數(shù)值。試驗重復3次。

1.7 參數(shù)計算以及統(tǒng)計分析

Scc/r、Fcc和Fei這3個參數(shù)計算見式(1)～(3)。

Scc/r=PpAc

(1)

式中：Scc/r為陽性樣品發(fā)生交叉污染比例；Pp為陽性樣品發(fā)生交叉污染的概率；Ac為特定烹飪方式占該食品所有烹飪方式的比例。

(2)

式中：Fcc為交叉污染菌量減少比例；N0為初始陽性樣品污染濃度；N1為接觸介質與陽性樣品接觸后帶菌量。

(3)

試驗均進行了2次平行，3次重復。試驗中菌量測定均參照GB4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[17]，最終結果以平均值±標準差來呈現(xiàn)。采用SPSS (IBM SPSS Version 17.0)軟件對參數(shù)值進行顯著性檢驗。通過配對T檢驗進行組間顯著性比較(P<0.05)。使用Origin(OriginLab Version 8.0)進行作圖。

2 結果與討論

2.1 兩組食源性致病菌-食品組合的Scc/r參數(shù)調研

根據(jù)公式計算結果，兩組食品-致病菌的Scc/r參數(shù)范圍為0.11%～44.85%。具體Scc/r參數(shù)值見表3。

表3 兩組食源性致病菌組合的Scc/r參數(shù)值

2.2 腸炎沙門氏菌-雞蛋的Fcc參數(shù)以及Fei參數(shù)確定

圖2為鮮蛋不同部位中腸炎沙門氏菌的Fcc參數(shù)。由圖2可知，鮮蛋中腸炎沙門氏菌的Fcc參數(shù)值為(2.59±0.28)%、(4.18±0.16)%。鮮蛋中細菌轉移率均較低，且蛋殼表面的轉移率略高于蛋液。2個場景下的Fcc參數(shù)值經(jīng)過顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)蛋殼和蛋液的Fcc參數(shù)具有顯著性差異(P<0.05)。這可能是由于不同粗糙程度對于細菌轉移的影響，粗糙介質更有利于細菌的轉移，這與Vorst等[18]研究結果相一致。

圖2 不同鮮蛋部位中腸炎沙門氏菌的Fcc參數(shù)Fig.2 Fcc parameters of Salmonella enteritisin different eggs sections

圖3為在不同場景下鮮蛋中腸炎沙門氏菌的Fei參數(shù)。由圖3可知，3種場景下Fei參數(shù)值范圍為(0.02±0.00)%～(0.33±0.01)%，參數(shù)值都較低且呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。不處理、無菌水清洗以及洗潔精水清洗3組操作之間均存在顯著性差異(P<0.05)。結果表明，清洗處理可大大降低腸炎沙門氏菌的轉移量，Robinson等[19]通過試驗也發(fā)現(xiàn)肥皂洗手或者使用手套可以在準備食物階段大大減少細菌的轉移。多個研究都證明了這一點[20-23]。但是并不能完全去除致病菌的殘留，這可能是由于細菌黏附在介質表面的緣故。

圖3 不同場景下鮮蛋中腸炎沙門氏菌的Fei參數(shù)Fig.3 Fei parameters of Salmonella enteritisin different scenarios

2.3 腸炎沙門氏菌-牛肉的Fcc參數(shù)以及Fei參數(shù)確定

圖4為不同接觸介質下牛肉中腸炎沙門氏菌的Fcc參數(shù)。由圖4可知，3種接觸介質下Fcc參數(shù)范圍為(43.68±9.16)%～(71.03%±16.82)%，3種介質的Fcc參數(shù)值經(jīng)過顯著性分析均無顯著性差異(P>0.05)。但是三者的參數(shù)值都呈現(xiàn)細菌的高轉移率，其中手部的Fcc參數(shù)值最高，高達(71.03±16.82)%，刀具與案板的Fcc參數(shù)值相近。可見操作者操作對于腸炎沙門氏菌的轉移具有巨大的影響。Chen等[24]和Hui等[25]也證實了這一結論，與本試驗的結果相一致。

圖4 不同接觸介質下牛肉中腸炎沙門氏菌的Fcc參數(shù)Fig.4 Fcc parameters of Salmonella enteritisin beef in different media

圖5為單一介質及組合介質牛肉中腸炎沙門氏菌的Fei參數(shù)。由圖5可知，單一介質及組合介質條件下，F(xiàn)ei參數(shù)值范圍為(17.63±6.75)%～(60.49±15.19)%，在單一介質情況下的手套的Fei參數(shù)值與刀具、案板的參數(shù)值具有顯著差異性(P<0.05)。3種介質都受到污染的Fei參數(shù)值最高，除了與手套接觸場景外，與其他設置場景都存在顯著差異性(P<0.05)。Luber等[26]進行廚房雞肉準備階段的交叉污染研究，發(fā)現(xiàn)雞腿與雞肉轉移到手部的轉移率分別為2.9%和3.8%，而受污染手部以及用具轉移到即食制品的轉移率為2.9%～27.5%，與本試驗結果有所差異。本試驗中牛肉中的沙門氏菌的轉移率范圍更為寬泛。這可能是因為菌種以及肉類產(chǎn)品的不同導致，同時由于廚房器具的組合也會導致轉移率的上升。

圖5 單一介質及組合介質牛肉中腸炎沙門氏菌的Fei參數(shù)Fig.5 Fei parameters of Salmonella enteritisin beef in different media

3 結論

本研究的結果可以完善快速定量風險評估工具中廚房階段腸炎沙門氏菌典型組合的相關交叉污染參數(shù)，填補原本參數(shù)的空缺。在完善參數(shù)的過程中，也同時發(fā)現(xiàn)交叉污染是重要的路徑之一。生熟不分離以及不完全的清洗都可能導致交叉污染的發(fā)生，從而引起大面積的食源性致病菌爆發(fā)，而操作者的操作規(guī)范程度也很大程度上影響了細菌的轉移。至此，就交叉污染路徑而言，需要更多的食源性致病菌-食品組合對交叉污染參數(shù)進行進一步的完善，不同接菌量的食源性致病菌導致的交叉污染情況也需要考慮在內。與此同時，為了更好地使用工具進行半定量風險評估，各地區(qū)的烹飪方式以及消費量的數(shù)據(jù)收集也是今后值得關注的重點。就半定量風險評估整體而言，其余污染路徑參數(shù)的完善與收集也是需要進一步研究的問題。